大白菜CBF冷應(yīng)答途徑中基因的克隆及其表達(dá)分析.pdf

1、擬南芥CBF轉(zhuǎn)錄因子是冷應(yīng)答途徑的關(guān)鍵成員，它位于冷應(yīng)答調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)上，一個(gè)CBF轉(zhuǎn)錄因子能激活下游眾多與抗逆有關(guān)的功能基因的表達(dá)。雖然植物中存在多條冷應(yīng)答途徑，但目前對(duì)CBF途徑的研究最為深入，功能最確切，所以其中的基因是植物抗寒分子育種的首選目標(biāo)。本研究以大白菜為實(shí)驗(yàn)材料，通過同源克隆的方法，從冷處理的幼葉中分離到CBF冷誘導(dǎo)途徑幾個(gè)關(guān)鍵成員的基因；對(duì)它們進(jìn)行了序列分析和功能預(yù)測，不同處理?xiàng)l件下的基因表達(dá)模式和轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系的研究，

2、內(nèi)容概括如下： 1.用PCR方法從大白菜中分離出COR-like基因的編碼區(qū)，命名為BcCOR。該基因編碼129個(gè)氨基酸的小分子蛋白。親水性預(yù)測表明該蛋白富含親水氨基酸殘基，是一種高度親水的蛋白質(zhì)，同時(shí)推測BcCORN端的1/3區(qū)域與葉綠體定位轉(zhuǎn)運(yùn)肽的序列極其相似。BcCOR蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以豐富的α-螺旋(72.87％)和無規(guī)卷曲(17.05％)兩種形式出現(xiàn)。這些特點(diǎn)與擬南芥AtCOR15a蛋白的結(jié)構(gòu)特征一致；BcCOR與擬南

3、芥AtCOR15a的核苷酸相似性為80.2％，氨基酸上的同源性71.4％，說明通過兼并引物克隆得到的基因?qū)儆贑OR基因家族，推測BcCOR具有與AtCOR15a相似的抗寒功能。 2.RNA雜交實(shí)驗(yàn)顯示，冷和脫水處理均能以相似的模式誘導(dǎo)BcCOR的表達(dá)，并且與已報(bào)道的擬南芥AtCOR基因轉(zhuǎn)錄譜基本一致，說明相同家族的基因具有表達(dá)和功能上的普遍性；但BcCOR基因的表達(dá)又具有自身的特殊性。一方面表現(xiàn)在BcCOR基因?qū)γ撍幚頉]有冷處

4、理敏感，這可能與該基因上游調(diào)控序列中不同種順式元件的多寡及活性有關(guān)。另一方面與擬南芥AtCOR不同的是，外源ABA不能誘導(dǎo)BcCOR的轉(zhuǎn)錄積累，這種同源基因表達(dá)模式的差別提示它們存在功能上的多樣性。 3.用兼并引物從冷誘導(dǎo)的大白菜(Brassicapekinensis)中克隆出兩個(gè)CBF/DREB1類基因，分別命名為BcCBF1、BcCBF2。序列分析顯示，各編碼蛋白含保守的AP2型DNA結(jié)合域，N末端核定位信號(hào)，C末端酸性激活

5、區(qū)及CBF/DREB1蛋白特征序列，與擬南芥CBF/DREB1類轉(zhuǎn)錄因子有很高的同源性。 4.mRNA積累特性表明，BcCBF1、BcCBF2均能被低溫在短時(shí)間內(nèi)強(qiáng)烈誘導(dǎo)，但對(duì)ABA和脫水脅迫無應(yīng)答，說明二者通過ABA非依賴途徑參與了冷應(yīng)答過程。與BcCBF1相比，BcCBF2積累較快而持續(xù)時(shí)間較短，BcCBF1可被鹽處理在12時(shí)左右弱誘導(dǎo)，而BcCBF2卻不能，顯示同類基因表達(dá)和功能的多樣性。 5.冷處理?xiàng)l件下，BcC

6、BF1、BcCBF2在葉中積累水平均比根中高，鹽處理?xiàng)l件下，BcCBF1葉片轉(zhuǎn)錄水平稍低于根，提示BcCBF1、BcCBF2的表達(dá)具有器官特異性，并且該特異性似乎又受不同的脅迫條件影響。 6.冷脅迫下光照顯著促進(jìn)大白菜BcCBFsmRNA的積累，說明光信號(hào)傳導(dǎo)途徑和CBF冷應(yīng)答途徑間的對(duì)話(Crosstalk)在高等植物中具有普遍性。 7.BcCBFs基因與BcCOR基因表達(dá)模式的比較提示了BcCBFs與BcCOR的上下