大白菜CcPAT1基因的克隆及其超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的構(gòu)建.pdf

1、擬南芥PAT1(phytochromeAsignaltransduction1)基因特異地在PhyA信號傳導(dǎo)途徑的早期起作用。但這個(gè)基因在大白菜（BrassicacampestrisL.ssp.pekinensis）中未見研究。本試驗(yàn)在自交系大白菜福山包頭中，分離了擬南芥(Ar口6idopsisthaliana)PAT1基因的同源基因，命名為CcPAT1（ChinesecabbagePAT1），構(gòu)建了CcPAT1基因的超表達(dá)載體pCAM

2、BIA2300-CcPAT1。為研究大白菜CcPAT1基因的功能，我們將該基因轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得了相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因植株。同時(shí)，由于大白菜的離體再生相當(dāng)困難，是蔬菜中最難脫分化和再分化的，這使得其轉(zhuǎn)基因研究難以進(jìn)行。我們建立了以下胚軸為外植體的高效穩(wěn)定再生遺傳轉(zhuǎn)化體系和以子葉-子葉柄為外植體的高效穩(wěn)定再生體系，以期將大白菜CcPAT1基因轉(zhuǎn)入大白菜，對其表達(dá)和基因功能作進(jìn)一步的分析。本研究對進(jìn)一步利用CcPAT1基因進(jìn)行大白菜遺傳改良有重要的理

3、論價(jià)值。
　　 主要結(jié)果如下:
　　 1、CcPAT1基因的克隆
　　 獲得一條分子質(zhì)量約為1500bp的均一擴(kuò)增條帶，經(jīng)測序，該DNA片段為1494bp，與預(yù)期的目的片段大小一致。構(gòu)建的超表達(dá)載體pCAMBIA2300-CcPAT1經(jīng)PCR、酶切驗(yàn)證，證明目的片段CcPAT1基因已經(jīng)連接到表達(dá)載體pCAMBIA2300上。
　　 2、PCR及測序鑒定轉(zhuǎn)基因擬南芥
　　 采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法

4、侵染擬南芥，獲得30棵左右轉(zhuǎn)基因植株。隨機(jī)提取2株擬南芥基因組DNA，以35S啟動(dòng)子的下游引物序列P35SL和CcPAT1基因的下游引物序列ccpat1a，擴(kuò)增外源CcPAT1基因，均擴(kuò)增出1500bp左右的片段，表明2棵擬南芥均是陽性植株。
　　 將上述PCR擴(kuò)增出來的目的片段測序結(jié)果與擬南芥PAT1基因及我們克隆的CcPAT1基因序列比對，結(jié)果表明導(dǎo)入擬南芥的外源基因與大白菜CcPAT1基因完全相同。因此，獲得了可以超表達(dá)C

5、cPAT1基因的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株。
　　 3、轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型觀察
　　 侵染后的植株在1/2MS培養(yǎng)基上篩選6-7天后，轉(zhuǎn)基因植株子葉深綠，根系不如野生型發(fā)達(dá)，而且比野生型晚發(fā)育1-2天。將轉(zhuǎn)基因與野生型幼苗移栽入基質(zhì)和蛭石的混合培養(yǎng)基20d左右的時(shí)間內(nèi)，轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株幾乎沒有表型變化。繼續(xù)觀察，擬南芥植株到初達(dá)開花期時(shí)，可以觀察到轉(zhuǎn)基因植株和野生型相比較，植株矮小，贏弱，葉片變小，發(fā)育較晚。
　　

6、4、以下胚軸為外植體的大白菜穩(wěn)定高效再生遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立:
　　 1)轉(zhuǎn)化頻率最高的基因型是Seoul，最佳篩選培養(yǎng)基配比是MS+2mg/L6-BA+1mg/LNAA+2mg/LAgNO3+300mg/LCar+10mg/LHyg，pH5.8，侵染液濃度OD600=0.5，侵染時(shí)間為10main。
　　 2)以大白菜雜交系Seoul下胚軸為外植體，與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)兩天后做GUS瞬時(shí)染色，發(fā)現(xiàn)下胚軸都能染出藍(lán)色，說明外源基

7、因已經(jīng)進(jìn)入植物細(xì)胞體內(nèi)并且表達(dá)。
　　 3)共培養(yǎng)后將外植體置于分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，10天左右后抗性愈傷長出，3周后抗性愈傷上分化出抗性芽。取愈傷組織及芽GUS染色后發(fā)現(xiàn)變成藍(lán)色，說明GUS基因已經(jīng)整合進(jìn)細(xì)胞的染色體中，并且穩(wěn)定表達(dá)。但我們從抗性芽很難得到陽性植株，原因可能是:大白菜雜交系的分化能力差，陽性芽褐化嚴(yán)重，極易死亡。在今后的試驗(yàn)中，還需要進(jìn)一步摸索防褐化條件，減少抗性芽的死亡，以期獲得轉(zhuǎn)基因植株。
　　 5、以

8、帶柄子葉為外植體的大白菜穩(wěn)定高效再生體系的建立:
　　 再生頻率最高的基因型是北京新2號，最佳分化培養(yǎng)基配是MS+5mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+4mg/LAgNO3,pH5.8
　　 6、以大白菜雜交系北京新2號帶柄子葉為外植體，與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)兩天后做GUS瞬時(shí)染色，發(fā)現(xiàn)子葉柄都能染出藍(lán)色，說明外源基因已經(jīng)進(jìn)入植物細(xì)胞體內(nèi)并且表達(dá)。但是，本試驗(yàn)中，經(jīng)農(nóng)桿菌侵染的大白菜外植體子葉-子葉柄在含有潮霉素的篩選培養(yǎng)基