茶樹響應(yīng)低溫脅迫的基因表達(dá)譜分析及抗寒相關(guān)基因的研究.pdf

1、低溫是一種很重要的非生物脅迫因子，限制農(nóng)作物的生長(zhǎng)、產(chǎn)量和地理分布。茶樹喜溫畏寒，我國(guó)大部分茶區(qū)冬季極端的低溫凍害和春、秋季突發(fā)的霜凍經(jīng)常發(fā)生，嚴(yán)重影響茶葉產(chǎn)量及品質(zhì)。如何提高茶樹抗寒性，一直是茶葉生產(chǎn)與理論研究上迫切需要解決的問題。因此，研究與了解茶樹低溫脅迫下的抗逆機(jī)制，有針對(duì)性地發(fā)掘相關(guān)抗逆基因并加以利用，是近年來茶樹栽培育種研究領(lǐng)域中的一個(gè)熱點(diǎn)。本文應(yīng)用抑制差減雜交技術(shù)，構(gòu)建茶樹SSH文庫，發(fā)掘與篩選了一批茶樹抗寒相關(guān)EST，用

2、RACE技術(shù)克隆出一種茶樹脫水素基因，用熒光定量PCR分析其表達(dá)特性，用純化的重組蛋白鑒定了其體外功能，并通過在煙草中過量表達(dá)研究了其抗逆性。這些研究結(jié)果將對(duì)解析茶樹響應(yīng)低溫的基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，研究與了解脫水素參與茶樹抗逆的作用，開展茶樹抗寒分子育種工作有著積極意義。論文取得以下主要結(jié)論：
　　 1、以茶樹葉片愈傷組織為材料，采用25℃與-5℃處理，成功構(gòu)建了茶樹低溫脅迫SSH文庫。隨機(jī)從正庫與反庫分別取384個(gè)克隆，采用斑點(diǎn)雜交篩

3、選技術(shù)，最終獲得了差異表達(dá)的UniESTs序列247條，Genbank登錄號(hào)為：JK264877～JK265128。
　　 2、參照MIPS分類法，UniESTs可分為7個(gè)大類，15個(gè)小類。其中，未知功能蛋白與無匹配的序列占30％，已知功能中比例最高的為細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因，占25.9％，其次是感知與響應(yīng)刺激的占18.6％，而與轉(zhuǎn)運(yùn)和植物發(fā)育的基因較少，只占4.5％和3.6％。這些基因主要包括：脅迫相關(guān)蛋白22條、活性氧清除酶類3

4、條、糖、蛋白質(zhì)和脯氨酸等滲調(diào)物質(zhì)合成酶類12條、細(xì)胞壁合成相關(guān)7條、脂代謝酶類7條、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的22條、物質(zhì)運(yùn)輸相關(guān)的7條、轉(zhuǎn)錄因子和翻譯調(diào)控相關(guān)的60條以及參與能量代謝與次生代謝基因14條等。
　　 3、利用RT-PCR和3’/5’RACE技術(shù)，首次克隆出一種茶樹脫水素基因CsDHN1，獲得登錄號(hào)FJ436978。其cDNA全長(zhǎng)960 bp，開放閱讀框606 bp，編碼的蛋白質(zhì)為201 aa，其分子量約為21 kD，等電點(diǎn)為

5、8-3。CsDHN1蛋白質(zhì)組成中，Gly占20.9％，Thr占18.4％，Lys占7.0％，His占6.0％，而沒有Cys、Trp。茶樹脫水素基因含有2個(gè)Y片段，1個(gè)S片段，2個(gè)K片段，屬于Y2SK2型脫水素。該序列與多種已知植物的脫水素基因相比，有37.4％～54.7％的同源性。通過分子生物信息學(xué)分析，該脫水素蛋白無疏水區(qū)、無跨膜區(qū)、無信號(hào)肽，不是膜蛋白，而可能是一種胞質(zhì)蛋白。
　　 4、茶樹脫水素基因CsDHN1為組成型表達(dá)

6、，在逆境及ABA誘導(dǎo)下可上調(diào)其轉(zhuǎn)錄水平。4℃低溫處理下表達(dá)量可提高4.2倍，而脫水處理能提高93.4倍CsDHN1對(duì)脫水、高鹽脅迫的響應(yīng)程度優(yōu)于低溫脅迫。在茶樹各組織器官中CsDHN1都有表達(dá)，其中種子中表達(dá)量最高，為葉片的11.2倍。
　　 5、構(gòu)建了pET32a-CsDHN1表達(dá)載體，在Rosetta(DE3)plysS表達(dá)宿主菌中成功表達(dá)出可溶性茶樹脫水素Cs DHN1融合蛋白(約45 kD)。誘導(dǎo)表達(dá)條件為：37℃，0.

7、5 mM IPTG誘導(dǎo)6 h。采用親和層析方法，用Ni-NTA Purification System純化獲得純度為98％目的重組蛋白。多克隆抗體anti-deyhydrin與重組蛋白可發(fā)生免疫雜交，證實(shí)所克隆的功能基因?yàn)槊撍亍?br>　　 6、在脫水和凍融處理中，純化的茶樹脫水素CsDHN1重組蛋白對(duì)MDH、LDH活性有明顯的保護(hù)作用，當(dāng)?shù)鞍着c酶比例為4時(shí)，可分別維持84.4％、47％的酶活性，抗脫水作用優(yōu)于在低溫下的保護(hù)作用。茶

8、樹脫水素CsDHN1在冷凍與脫水條件，具有穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。
　　 7、構(gòu)建了茶樹脫水素基因CsDHN1植物表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌葉盤轉(zhuǎn)化法將其導(dǎo)入煙草中，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。PCR分子檢測(cè)表明該基因已整合到煙草基因組DNA，并能正常轉(zhuǎn)錄。
　　 8、轉(zhuǎn)基因煙草的保水力及抗?jié)B透脅迫能力較強(qiáng)，表現(xiàn)出良好的抗旱性。轉(zhuǎn)基因煙草葉片離體20 h后失水率僅為36.9％，而非轉(zhuǎn)基因達(dá)到60.3％；20％PEG6000滲透脅迫24 h