蒙古馬免疫相關(guān)基因表達研究及脾臟表達譜分析.pdf

1、中國馬業(yè)正處在從傳統(tǒng)馬業(yè)向現(xiàn)代馬業(yè)轉(zhuǎn)型的過程中，急需培育出適應(yīng)我國自然環(huán)境的馬匹新品種（系）。為此，對優(yōu)良地方品種蒙古馬免疫相關(guān)基因進行研究，不但可以進一步了解蒙古馬抗病力強的原因，為揭示蒙古馬抗病力遺傳特性提供理論依據(jù)，而且可以對蒙古馬種質(zhì)資源的保護、利用和創(chuàng)新起到積極的作用，并指導(dǎo)地方品種馬的雜交改良、品種（系）的培育。本研究以蒙古馬為研究對象，以純血馬為對照，首先對蒙古馬與純血馬血液生化、免疫和抗氧化指標(biāo)進行測定分析，判斷正常生理

2、情況下，蒙古馬與純血馬血液指標(biāo)是否存在差異，從總體上掌握兩個品種馬抗病力的情況；其次，對馬匹抗病候選基因TLR2、TLR4多態(tài)性進行研究，分析兩個品種馬基因型的差異性；再次，采用實時熒光定量RT-PCR（RT-qPCR）的相對定量方法對兩個品種馬不同組織中TLRs基因的表達量進行差異分析，同時對在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)下的兩個品種馬單核細胞與免疫相關(guān)基因的差異表達進行研究，得到各基因的相對表達量，進而分析免疫相關(guān)基因?qū)Σ煌贩N間抗性的影響

3、；最后，利用高通量測序技術(shù)對蒙古馬與純血馬脾臟表達譜文庫進行測序，以尋找兩個品種馬脾臟組織中的差異表達基因。通過本研究的結(jié)果可以為揭示蒙古馬抗病力遺傳特性提供理論依據(jù)，并獲得以下主要研究結(jié)果：
　　1．通過對血液生化、免疫和抗氧化指標(biāo)的結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，純血馬血液中白蛋白和膽固醇的含量偏高，這與其飼料營養(yǎng)水平相一致；蒙古馬血液中球蛋白、IgG和IgA的含量均顯著高于純血馬（P＜0.05），推測與蒙古馬的免疫力高有關(guān)。
　　2．采

4、用PCR-SSCP技術(shù)對蒙古馬與純血馬TLR2基因進行分型，兩個群體都呈現(xiàn)出三種基因型（AA、AB和BB型）；經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)該基因外顯子存在兩處突變：編碼區(qū)945bp位置G→C的同義突變和1070bp位置G→A的錯義突變；由于密碼子的擺動性，945bp位置并未導(dǎo)致精氨酸的突變；而1070bp位置由精氨酸突變?yōu)楣劝滨０?。對基因型統(tǒng)計分析，蒙古馬與純血馬品種之間不同基因型分布存在顯著差異（0.01≤P＜0.05）。
　　3．通過直接測序方

5、法發(fā)現(xiàn)，蒙古馬與純血馬TLR4基因第3外顯子共發(fā)現(xiàn)11處堿基突變，其中8處（520bp位置T→G，668bp位置A→G，817bp位置C→T，1003bp位置C→T，1513bp位置T→C，1546bp位置G→A，1771bp位置T→C和1903bp位置T→C）為同義突變；其他3處，713bp位置C→A導(dǎo)致谷氨酰胺變?yōu)橘嚢彼幔?353bp位置T→C使甲硫氨酸變?yōu)樘K氨酸，1673bp位置A→G導(dǎo)致甲硫氨酸變?yōu)槔i氨酸，并且這3處不同基因型分

6、布存在極顯著差異（P＜0.01）。
　　4．采用RT-qPCR的2-△Ct方法對蒙古馬與純血馬TLR1-9基因在肝臟、脾臟、肺臟、盲腸和骨髓組織進行了差異表達研究。結(jié)果表明各基因在5個組織中均有表達；TLRs基因在免疫器官（脾臟和骨髓）中的表達量為蒙古馬高于純血馬；而在肝臟中為蒙古馬低于純血馬。
　　5．馬外周血單核細胞經(jīng)LPS刺激后，無論是蒙古馬還是純血馬TLR4、CD14、MD-2、TNF-α、INF-β、IL-1β、I

7、L-6和IL-8基因表達量都有所增加（與對照組相比）；TLR4、CD14、IL-1β、IL-6和IL-8基因的表達量均是蒙古馬低于純血馬，其中TLR4基因和 IL-1β基因表達差異顯著（P＜0.05）。單核細胞上清液中細胞因子（TNF-α、INF-β、IL-1β和IL-8）含量在兩個品種之間差異不顯著（P≥0.05）。
　　6．構(gòu)建了蒙古馬-脾臟和純血馬-脾臟組織表達譜文庫，經(jīng)Illumina Miseq高通量測序，分別獲得了68