檉柳根部響應(yīng)高鹽脅迫基因表達(dá)譜的建立及相關(guān)基因克隆.pdf

1、檉柳(Taramix sp.)具有強(qiáng)的耐鹽堿能力，是進(jìn)行植物耐鹽堿機(jī)理研究的理想材料。為研究鹽脅迫下檉柳根部的耐鹽機(jī)理，本研究以0.4 mol/L NaCl 脅迫處理剛毛檉柳(Tamarixhispida)根部組織為試材，分別構(gòu)建對(duì)照及脅迫24 h、48 h的3個(gè)cDNA文庫(kù)。3個(gè)文庫(kù)的初始滴度為1.0×10<'6> pfu、1.4×10<'6>：pfu、1.2×10<'6>pfu，插入片段平均長(zhǎng)度分別為0.8 kb、0.9kb、0.8

2、5 kb，平均重組率為98.2％。 通過(guò)對(duì)3個(gè)cDNA文庫(kù)克隆的隨機(jī)測(cè)序共獲得7 726條有效的EST序列，其GenBank注冊(cè)號(hào)為 EG966290～EG974015，這些EST代表了4 168條無(wú)重復(fù)的單一序列(uniquesequence)，其中包括1142條configs和3026條singlets。其中4 508 條EST與與NCBI的Nr數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知蛋白序列相似，并將它們按功能分成11類，占比例最高的是蛋白質(zhì)合成類

3、(protein synthesis)基因，約21.4％，功能未知(Function unknown)和轉(zhuǎn)運(yùn)類(Transport facilitation)分別占15％和12.2％，代謝類(Metabolism)占11.2％、細(xì)胞防御(Cell rescue，defense)占7.3％、能量(Energy)占7.0％、細(xì)胞結(jié)構(gòu)類(Cell structure)6.8％、轉(zhuǎn)錄(Transcription)占5.1％、蛋白質(zhì)定位(Prot

4、ein destination)4.8％、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Signal transduction)占4.1％、細(xì)胞生長(zhǎng)/分裂(Cell growth，division)占3.7％。 3個(gè)cDNA文庫(kù)中共有860條EST與抗逆相關(guān)，其中，活性氧清除的基因(27％)、脅迫響應(yīng)(16％)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)(16％)、蛋白質(zhì)合成及降解基因(10％)，代謝和能量、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)運(yùn)所占比例次之，轉(zhuǎn)錄調(diào)控和滲透調(diào)物質(zhì)合成基因最少，各占3％。 通過(guò)對(duì)3

5、個(gè)文庫(kù)的EST的分析及比較，發(fā)現(xiàn)共有106條基因在NaCl脅迫前后呈差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)34條上調(diào)表達(dá)基因，27條下調(diào)表達(dá)基因，45條基因出現(xiàn)暫時(shí)差異表達(dá)，其中H<'+>-ATP 合成酶、ABA 脅迫成熟蛋白、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、金屬硫蛋白、類萌芽素蛋白、晚期胚胎富集蛋白類ERD15和LEA5等基因脅迫后表達(dá)豐度上升；而細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白富含脯氨酸蛋白及木糖葡聚糖型內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)糖基化酶等基因脅迫后表達(dá)量下降；蛋白質(zhì)翻譯延伸因子EFlα和翻譯起始因子 eIF

6、5a等基因脅迫后出現(xiàn)瞬時(shí)的上升或下降。 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，分別研究文庫(kù)中獲得的8種POD和7種水通道蛋白基因在NaCl脅迫前后檉柳根和葉組織中的表達(dá)差異。結(jié)果表明，鹽脅迫后POD基因在檉柳根和葉組織細(xì)胞中的表達(dá)模式相同，在脅迫24 h時(shí)出現(xiàn)瞬時(shí)抑制現(xiàn)象；水通道蛋白基因在鹽脅迫在根、葉器官中有表達(dá)模式有明顯的差異。鹽脅迫后7種水通道蛋白基因在根部表達(dá)量上升；在葉部它們脅迫后表達(dá)量下降。 從文庫(kù)中克隆獲得了25條抗

7、逆相關(guān)基因的全長(zhǎng)cDNA序列，這些基因這些基因分屬于：細(xì)胞防御、離子平衡和轉(zhuǎn)運(yùn)、抗病、細(xì)胞壁成分、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與調(diào)控、水分脅迫相關(guān)蛋白、蛋白質(zhì)的合成與降解。 從鹽脅迫下檉柳眾多基因的表達(dá)特征信息可推斷，檉柳根部對(duì)鹽脅迫響應(yīng)的過(guò)程可能是一個(gè)復(fù)雜的多基因協(xié)同作用的過(guò)程，涉及活性氧清除、細(xì)胞壁組分、脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與基因的表達(dá)調(diào)控、水分和離子的轉(zhuǎn)運(yùn)、脫水保護(hù)等多種途徑。從而為系統(tǒng)闡明檉柳抗鹽分子機(jī)理奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。對(duì)剛毛檉柳抗逆基因的克隆，可