鹽脅迫對花生膜脂組分及相關(guān)基因表達(dá)的影響.pdf

1、本文以含油量豐富的花生品種魯花14為試驗材料來研究在鹽脅迫及恢復(fù)處理下花生幼苗的生理特性。并對不同處理的花生幼苗進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，通過分析測序結(jié)果找出與膜脂組分變化相關(guān)的關(guān)鍵基因。本研究主要內(nèi)容包括：
　?、艦榱擞^察鹽脅迫及復(fù)水處理對花生幼苗生理指標(biāo)的影響，對250mM NaCl處理4天（S4）及復(fù)水3天（R3）的花生幼苗進(jìn)行生理指標(biāo)（熒光參數(shù)，膜脂組成，活性氧及抗氧化酶等）的測定。測定結(jié)果表明，在250 mM NaCl處理時，花生

2、幼苗的生長受到明顯抑制?；ㄉ~片的不飽和脂肪酸含量，不飽和度（DBI），F(xiàn)v/Fm，抗氧化酶活性，ΦPSII明顯下降。其中亞麻酸含量（18:3）下降了42.5％，而Fo和NPQ卻明顯升高。然而，在恢復(fù)處理時，花生幼苗的不飽和脂肪酸含量（18:3）及不飽和度（DBI）略有升高。Fv/Fm，ΦPSII及抗氧化酶（APX，SOD）活性也有所上升。O2??和H2O2的含量有所下降。然而，在恢復(fù)處理時PSI的活性卻沒有明顯變化。根據(jù)這些結(jié)果我們推

3、測，在250 mM鹽處理時，花生幼苗各種生理指標(biāo)的下降可能與不飽和脂肪酸含量及不飽和度（DBI）的下降有關(guān)?；ㄉ~片不飽和脂肪酸含量的降低引起了細(xì)胞膜穩(wěn)定性的下降。細(xì)胞膜穩(wěn)定性的下降導(dǎo)致了PSII對鹽脅迫耐受性的降低，使實際光化學(xué)效率降低，過剩光能大量積累，引起光抑制。光抑制又會產(chǎn)生過多的活性氧，最終產(chǎn)生氧化脅迫。然而，恢復(fù)條件下不飽和脂肪酸含量的升高可能有利于緩解鹽脅迫對花生幼苗的光抑制。
　　⑵對三葉一心階段的花生幼苗進(jìn)行營養(yǎng)

4、液處理4天（CK），鹽處理四天（S4），恢復(fù)3天（R3，鹽處理四天后復(fù)水3天處理）處理后取材提RNA并選取質(zhì)量合格的RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。通過對測序結(jié)果進(jìn)行分析統(tǒng)計共獲得總reads數(shù)135,144,930。通過整理，組裝去除低質(zhì)量的reads，最終獲得的clean reads數(shù)為131,459,048。這些clean reads的Q20（1%的錯誤率）達(dá)到80.02%。說明這些測序結(jié)果是合格的。通過對獲得的clean reads進(jìn)行差

5、異性分析，最終結(jié)果表明，在CK-VS-S4（以下簡稱鹽處理）有1742個基因差異表達(dá)。其中，有898個基因上調(diào)，844個基因下調(diào)。而在 S4-VS-R3（以下簡稱恢復(fù)處理）處理組，有390個基因差異表達(dá)。其中323個基因上調(diào)，67個基因下調(diào)。在這些差異基因中我們選取了12個差異表達(dá)基因進(jìn)行熒光定量PCR驗證，驗證結(jié)果表明我們的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)是可靠的，說明轉(zhuǎn)錄組測序的數(shù)據(jù)可以用來進(jìn)行深入分析。通過對差異基因進(jìn)行GO及KEGG分析，我們篩選到兩

6、個與不飽和脂肪酸合成相關(guān)的關(guān)鍵基因（CL8534.Conting6, CL8534.Conting7），這兩個基因都編碼ω-3脂肪酸去飽合酶，在鹽處理條件下這兩個關(guān)鍵基因下調(diào)表達(dá)，而在恢復(fù)處理條件下上調(diào)表達(dá)。因此，我們初步推測在恢復(fù)處理條件下花生葉片中不飽和脂肪酸含量的升高可能與這些關(guān)鍵基因的上調(diào)有關(guān)。關(guān)鍵基因的上調(diào)，引起了不飽和脂肪酸含量的改變，使細(xì)胞膜的穩(wěn)定性有所增加，細(xì)胞膜穩(wěn)定性的增加對鹽脅迫引起的光抑制起到了一定的緩解作用。

7、r>　?、菂⒖嫁D(zhuǎn)錄組測序得到的ω-3脂肪酸去飽和酶基因序列設(shè)計引物，通過PCR擴(kuò)增基因的全長序列。最終克隆出基因長度為1199 bp（總長2227）的中間序列。通過NCBI數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)該序列與花生ω-3脂肪酸去飽和酶基因序列的相似度為100%，說明該基因片段確實是ω-3脂肪酸去飽和酶基因的中間片段。通過對已克隆出的中間片段進(jìn)行不同時間不同濃度鹽處理的基因表達(dá)驗證，發(fā)現(xiàn)隨著處理時間的增長及鹽濃度的升高，該基因片段的表達(dá)量都有所下降。但是