油茶種子發(fā)育過程組分及脂類代謝相關(guān)基因表達(dá)變化研究.pdf

1、油茶泛指山茶科(Theaceae)山茶屬（Camellia）中具有生產(chǎn)價(jià)值的油用物種，是中國重要木本油料樹種，其中普通油茶（Camellia oleifera Abel）栽培面積最廣、產(chǎn)量最高，在生產(chǎn)中應(yīng)用最廣泛。自“六五”以來，研究者們在普通油茶果實(shí)產(chǎn)量、果實(shí)性狀及采后加工、茶油營養(yǎng)成分、茶油儲藏等方面開展了大量研究，并已獲得了巨大進(jìn)展。但對油茶種子發(fā)育過程中果實(shí)形狀、種子的物質(zhì)組成及重要性狀控制基因的表達(dá)變化規(guī)律等研究較少。研究油茶

2、果實(shí)和種子的生長發(fā)育規(guī)律，探索種子發(fā)育過程中重要營養(yǎng)成分的合成貯存規(guī)律，將為采用分子手段調(diào)控油茶種子重要營養(yǎng)成分合成，進(jìn)一步提高茶油的營養(yǎng)保健價(jià)值奠定理論基礎(chǔ)。本文分析了油茶果實(shí)和種子發(fā)育過程中表型性狀、物質(zhì)組成、重要性狀基因表達(dá)量等指標(biāo)的變化規(guī)律，具體研究內(nèi)容如下:
　　 (1)分析了普通油茶長林系列4號、40號和166號3個(gè)無性系5-10月份果實(shí)果形、果重和種子的重量、鮮果出籽率等指標(biāo)在果實(shí)生長過程中的變化規(guī)律。分析表明，3

3、個(gè)無性系5月份果實(shí)大部分為圓橄欖形，8月份果形變化較大，到9月份基本分化成各無性系的特征果形;果實(shí)6-8月份間果實(shí)為迅速膨大期，果實(shí)重量和縱、橫徑大小在此時(shí)增長量最大，9月份之后果實(shí)重量和大小基本保持恒定;種皮厚度各月變化不大。種子重量和大小6-10月持續(xù)增長，其中6-8月份生長速度較快。鮮果出籽率6-8月迅速提高，9月份后基本穩(wěn)定。因此6-8月是油茶果實(shí)及種子迅速生長期。
　　 (2)檢測了長林系列4號、40號和166號3個(gè)無

4、性系7-10月種子的主要物質(zhì)組成，結(jié)論如下:3個(gè)無性系的種子含水率5-10月均處于逐漸下降的趨勢，其中8-10月水分含量迅速下降。鮮籽含油率7-10月持續(xù)增加，而8-10月份增長幅度最大。蛋白質(zhì)、淀粉含量與油脂含量的變化規(guī)律基本一致，可溶性糖含量各月份變化不大。茶皂素含量隨種子成熟不斷提高。可見8-10月份是普通油茶種子主要物質(zhì)積累期。
　　 (3)采用solexa技術(shù)對長林4號無性系7-10月份種子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，獲得大于20

5、0bp的unigene77050條。其中包括脂肪酸合成相關(guān)13個(gè)酶的99條unigene、脂肪酸鏈延長相關(guān)5個(gè)酶的8條unigene、7個(gè)脂肪酸去飽和酶的77條unigene，及與角鯊烯和茶皂素合成相關(guān)的4個(gè)重要酶的34條unigene等。并比較了7-10月份unigenes的RPKM值大小。
　　 (4)篩選了6個(gè)主要油茶物種的相對穩(wěn)定的內(nèi)參基因。參考其他物種的內(nèi)參基因，并以RNA-Seq數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，選擇種子發(fā)育過程中表達(dá)量相

6、對穩(wěn)定的15個(gè)基因，用qRT-PCR方法分析15個(gè)基因在浙江紅花油茶、宛田紅花油茶、廣寧紅花油茶、攸縣油茶、小果油茶和普通油茶等6個(gè)油茶物種的根、莖、葉、花、種子中表達(dá)量的穩(wěn)定性，結(jié)果表明不同物種和不同組織最穩(wěn)定的內(nèi)參基因不完全一致，其中TUBα-3、CESA及ACT7α為各物種和組織的表達(dá)量相對穩(wěn)定的內(nèi)參基因。
　　 (5)以篩選出的CESA為內(nèi)參，用qRT-PCR方法分析了4個(gè)脂類代謝途徑29個(gè)相關(guān)酶基因不同時(shí)期的表達(dá)量，并

7、進(jìn)一步研究了在不同時(shí)期這些酶基因表達(dá)量與其相關(guān)代謝產(chǎn)物含量的相關(guān)性。比較采用qRT-PCR和RNA-Seq方法分析基因的表達(dá)量，結(jié)果表明兩種方法檢測的結(jié)果基本一致，但存在細(xì)微的差異。例如脂肪酸合成過程中BCCP基因、脂肪酸鏈延長的ECH基因和脂肪酸去飽和酶FAD8基因?；虮磉_(dá)與代謝相關(guān)產(chǎn)物含量變化相關(guān)性分析表明脂肪酸合成相關(guān)基因表達(dá)量變化提前于產(chǎn)物含量變化，而類固醇生物合成代謝中如角鯊烯合酶(SQS)和鯊烯環(huán)氧酶(SQE)基因表達(dá)量與

8、角鯊烯和甾醇含量變化趨勢一致。
　　 (6)克隆了油茶籽油中重要營養(yǎng)成分角鯊烯合成的兩個(gè)關(guān)鍵酶SQS和SQE基因。采用RACE方法，分離的普通油茶SQS基因cDNA全長1490bp，開放閱讀框1245bp，編碼414個(gè)氨基酸，SQE基因cDNA全長2058bp，開放閱讀框1605bp，編碼534個(gè)氨基酸。采樣同源克隆方法，也分離出浙江紅花油茶、宛田紅花油茶、廣寧紅花油茶、攸縣油茶、小果油茶的SQS和SQE基因，6個(gè)油茶物種中SQ

9、S和SQE基因cDNA同源性分別達(dá)到99.44％和99.47％
　　 (7)利用pMDC32真核表達(dá)載體驗(yàn)證了油茶SQS和SQE的功能。采用Gateway技術(shù)分別構(gòu)建了油茶SQS和SQE基因超表達(dá)載體pMDC32-SQS和pMDC32-SQE，表達(dá)載體通過農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)轉(zhuǎn)化到粘紅酵母中，利用PCR檢測篩選陽性轉(zhuǎn)化子，培養(yǎng)陽性轉(zhuǎn)基因酵母菌株，提取酵母油脂，分析油脂中角鯊烯和甾醇含量。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)pMDC32-SQS的粘紅酵

10、母油脂中角鯊烯和甾醇含量分別低于對照26.26％和38.8％，而轉(zhuǎn)pMDC32-SQE的粘紅酵母油脂中甾醇含量比野生型提高202.62％，角鯊烯含量降低了41.09％。但相同的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，單位體積的培養(yǎng)基中兩組轉(zhuǎn)基因粘紅酵母培養(yǎng)相同時(shí)間后，pMDC32-SQS和pMDC32-SQE的粘紅酵母油脂酵母的產(chǎn)量比對照分別提高了81.96％和183.52％，總油脂產(chǎn)量也相應(yīng)分別提高了69％和175％。
　　 本研究基本明確了油茶果實(shí)和種