黨參SSH與cDNA文庫構建.pdf

1、黨參為桔?？浦参稂h參[Codonopsispilosula(Franch.)Nannf]、素花黨參CodonopsispilosulaNannf.var.modesta(Nannf.)L.T.Shen或川黨參CodonopsistangshenOliv.的干燥根。黨參屬植物全世界約有40種，中國約有39種，藥用有21種、4變種。課題組前期AFLP研究發(fā)現(xiàn)，造成黨參質量差異的主要原因之一是種群間、種內問遺傳變異。即使在同一種植基地，不同種

2、質黨參居群問遺傳差異仍然大于居群內變異，由此結構基因角度證明種質遺傳差異是形成黨參道地性的內因。但是，道地黨參種質基因表達規(guī)律及決定黨參道地性的本質原因仍未能闡明。因此，尋找新的切入點，探索黨參次生代謝相關基因在黨參道地性形成中的具體作用，就成為黨參進一步研究的重點。為尋找黨參次生代謝相關功能基因，本研究采用改良CTAB法提取黨參總RNA，在建立較穩(wěn)定有效的黨參總RNA提取方法的基礎上，利用SSH技術尋找黨參差異功能基因，并建立了cDN

3、A文庫，通過EST測序，從分子水平上研究黨參種質遺傳差異及其道地性形成具體機制，對其功能基因進行初步探討。
　　 論文主要內容如下：
　　 1.黨參葉片總RNA提取方法的建立
　　 以采自海拔1527m的山西陵川GAP種植基地的3年生黨參[Codonopsispilosula(Franch.)Nannf]幼嫩葉片為材料。通過對改良CTAB法、TRIzol試劑盒法和某公司RNA提取試劑盒法對黨參葉片總RNA提取效果

4、的比較研究，尋找適合黨參葉片組織的有效的總RNA提取方法。結果表明，改良CTAB法提取的總RNA純度最高，沒有小分子鹽類雜質，也沒有蛋白質污染；經甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳分析，改良CTAB法提取的黨參總RNA28S與18S條帶的亮度比約為1.5～2.0，基本上無降解，點樣孔無污染，無拖尾現(xiàn)象，表明改良CTAB法是一種提取高質量黨參葉片總RNA的有效方法。
　　 2.黨參抑制消減雜交文庫的建立
　　 以采自海拔1529m的山

5、西陵川GAP種植基地的2年生和3年生黨參[Codonopsispilosula(Franch.)Nannf]幼嫩葉片為材料，采用建立的改良CTAB法提取總RNA。以2年生黨參葉片提取的總RNA為Tester，以3年生黨參葉片提取的總RNA為Driver進行消減雜交。結果表明，同時期2年生黨參和3年生黨參間差異基因較少，難以篩選。排除同種同時期不同年份黨參間選樣方法。
　　 3.黨參cDNA文庫的構建
　　 以采自海拔15

6、29m的山西陵川GAP種植基地2年生黨參[Codonopsispilosula(Franch.)Nannf]幼嫩葉片為材料，采用建立的改良CTAB法提取總RNA，純化mRNA反轉錄后，經RsaI酶切后，分別加上接頭，與pGEM-Teasy載體連接后，轉化DH5α，建立cDNA文庫。隨機篩選41個克隆并測序，對所得序列進行Blastx和Blastn比對分析，得到40個Unisequence。其中,30個序列得到有生物學意義的顯著相似性的蛋

7、白比對結果，16個有生物學意義上的高度同源性。所得EST序列中,4個序列與已知蛋白具有高度同源性，F(xiàn)658、F430、F323、F468和F646分別與類細胞色素P450(Nicotianatabacum)、L2核糖體蛋白(Anisophylleafallax)、12-氧代植物二烯酸還原酶(Heveabrasiliens)、烯醇酶(Solanumlycopersicum)、過氧化還原酶[Populustrichocarpa]＞gb丨EE