人牙根尖乳頭干細(xì)胞對單核巨噬細(xì)胞活化和極化的影響.pdf

1、研究目的:
　　人牙根尖乳頭干細(xì)胞(stem cells from the apical papilla，SCAPs)，是一種來源于正在發(fā)育的牙根尖乳頭組織的間充質(zhì)干細(xì)胞，在年輕恒牙的牙根發(fā)育中發(fā)揮重要作用。間充質(zhì)干細(xì)胞具有免疫調(diào)控功能，那么SCAPs是否對免疫細(xì)胞有一定的調(diào)控作用，目前尚不清楚。單核巨噬細(xì)胞在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，被微生物及各種趨化因子活化可產(chǎn)生IL-6、TNF-α等炎性因子，從而導(dǎo)致炎癥的發(fā)生、發(fā)展。根據(jù)巨噬

2、細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和表型可將其分為兩種極化類型，即促進(jìn)炎癥發(fā)生的M1型巨噬細(xì)胞和促進(jìn)組織修復(fù)的M2型巨噬細(xì)胞。有研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞能夠抑制單核巨噬細(xì)胞的活化并促進(jìn)其向M2型極化從而達(dá)到免疫抑制的作用，本實驗初步探討SCAPs對單核巨噬細(xì)胞活化和極化的免疫調(diào)控作用。
　　實驗方法和結(jié)果
　　1.細(xì)胞培養(yǎng):
　　(1)SCAPs的培養(yǎng):收集因正畸治療需要而拔除的未發(fā)育完全的健康第三磨牙，無菌分離根尖乳頭組織，采用酶消化

3、法分離培養(yǎng)SCAPs。
　　(2)單核細(xì)胞系THP-1、U937傳代培養(yǎng)。
　　(3)人單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞(Monocyte-derived macrophages，MDM):淋巴細(xì)胞分離管分離健康人的外周血獲得外周血單個核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，將PBMC細(xì)胞懸液置培養(yǎng)皿中過夜，其中的單核細(xì)胞可貼壁成巨噬細(xì)胞。
　　2.SCAPs促進(jìn)單核細(xì)胞THP-1

4、向M2樣巨噬細(xì)胞極化 SCAPs與THP-1通過Transwell小室進(jìn)行共培養(yǎng)，實驗組為SCAPs+THP-1;對照組為THP-1。qPCR結(jié)果顯示實驗組THP-1中與M1型巨噬細(xì)胞相關(guān)的TNF-α和IL-12在共培養(yǎng)1d時升高，其余時間點均呈下降趨勢（p＜0.5），與M2型巨噬細(xì)胞相關(guān)的IL-10、TGF-β1、CD163、CD206均升高（p＜0.5），僅CD206在共培養(yǎng)3d時有下降趨勢;流式細(xì)胞術(shù)檢測共培養(yǎng)3d THP-1中T

5、NF-α的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)實驗組的TNF-α表達(dá)顯著下降（＜0.5），與qPCR結(jié)果一致;WesternBlotting檢測共培養(yǎng)后THP-1中stat3/P-stat3、smad3/P-smad3的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)實驗組P-stat3/stat3蛋白相對表達(dá)水平較對照組呈上升趨勢（p＜0.5）而P-smad3/smad3蛋白相對表達(dá)水平則未見明顯變化（p＞0.5），表明SCAPs促進(jìn)THP-1向M2樣巨噬細(xì)胞極化，可能與stat3通路的激

6、活有關(guān)。
　　3.SCAPs抑制PMA誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中TNF-α的表達(dá)
　　單核細(xì)胞系THP-1、U937通過佛波酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)誘導(dǎo)成巨噬細(xì)胞后與SCAPs共培養(yǎng)，實驗組為巨噬細(xì)胞+SCAPs;對照組為巨噬細(xì)胞。qPCR檢測共培養(yǎng)后巨噬細(xì)胞樣THP-1中炎性因子和表面標(biāo)志物的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)實驗組TNF-α的表達(dá)顯著下降（p＜0.5），而與極化相關(guān)的其他分子則無明顯

7、變化，僅IL-10、CD163在共培養(yǎng)的初期較對照組升高（p＜0.5），實驗組巨噬細(xì)胞樣U937中TNF-α的表達(dá)也顯著下降（p＜0.5）。通過ELISA檢測共培養(yǎng)上清中的TNF-α的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)實驗組上清中TNF-α的表達(dá)下降（p＜0.5），進(jìn)一步證實與SCAPs共培養(yǎng)后，巨噬細(xì)胞樣THP-1和巨噬細(xì)胞樣U937分泌的TNF-α降低，表明SCAPs對PMA誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞極化作用不明顯，卻對TNF-α抑制作用明顯增強(qiáng)。
　　4.S

8、CAPs上清抑制人單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞的活化
　　PBMC中的單核細(xì)胞貼壁成巨噬細(xì)胞后棄上清，加適量的SCAPs條件培養(yǎng)液培養(yǎng)4d，實驗組為SCAPs條件培養(yǎng)液+MDM;對照組為α-MEM培養(yǎng)液+MDM。通過qPCR檢測MDM炎性因子表達(dá)情況，實驗組TNF-α、IL-12、IL-6、IL-1β的表達(dá)均較對照組降低（p＜0.5），而實驗組IL-10、TGF-β1的表達(dá)無明顯變化（p＞0.5），說明SCAPs上清可以抑制MDM的活化。