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![共培養(yǎng)體系下巨噬細(xì)胞對胃癌干細(xì)胞影響的研究.pdf_第1頁](https://static.zsdocx.com/FlexPaper/FileRoot/2019-3/10/8/5afbe046-2ebb-4df4-b69b-0e060fd6b775/5afbe046-2ebb-4df4-b69b-0e060fd6b7751.gif)
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文檔簡介
1、乳斑區(qū)聚集大量巨噬細(xì)胞,具有重要的免疫功能,參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移,尤其在腫瘤血管生成方面起著關(guān)鍵作用。胃癌腹膜轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)與胃癌細(xì)胞選擇性侵襲乳斑密切相關(guān)。以往的研究發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞侵襲乳斑后胃癌細(xì)胞大部分被巨噬細(xì)胞消滅。但殘留在乳斑內(nèi)一小部分細(xì)胞可以在巨噬細(xì)胞環(huán)境中繼續(xù)生存并出現(xiàn)擴增??紤]這一部分具有復(fù)制能力和免疫逃逸的殘留細(xì)胞為胃癌干細(xì)胞。
目的:為研究乳斑區(qū)巨噬細(xì)胞對胃癌干細(xì)胞的作用影響,本實驗設(shè)計了胃癌干細(xì)胞與巨噬細(xì)
2、胞共培養(yǎng)體系,在共培養(yǎng)體系下模擬乳斑區(qū)胃癌干細(xì)胞的微環(huán)境,擬探求胃癌干細(xì)胞微環(huán)境的變化。
方法:實驗首先通過成球法從人胃癌細(xì)胞系SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)、分離、傳代胃癌干細(xì)胞,通過熒光染料Hoechst33342對細(xì)胞進行染色,應(yīng)用流式細(xì)胞儀監(jiān)測并分選胃癌干細(xì)胞,為共培養(yǎng)實驗提供胃癌干細(xì)胞。在建立的共培養(yǎng)體系下,用MTT法檢測胃癌干細(xì)胞存活率。監(jiān)測胃癌干細(xì)胞平板克隆能力的變化以及應(yīng)用RT-PCR法、Western Blot、E
3、LASA法檢測胃癌干細(xì)胞表達(dá)Caspase-3/9、IL-4,IL-10、INF-γ、IL-12、MMP-2、MMP-9、MCP-1、COX-2、PGE2、VEGF、TGF-β的變化。
結(jié)果:共培養(yǎng)體系下胃癌干細(xì)胞活力隨巨噬細(xì)胞濃度的升高2×105/ml、4×105/ml后被明顯抑制。共培養(yǎng)體系下無巨噬細(xì)胞組的胃癌干細(xì)胞克隆形成率為(0.811±0.035)%,1×105細(xì)胞組胃癌干細(xì)胞的克隆形成率為(0.612±0.157)
4、%,2×105細(xì)胞組的胃癌干細(xì)胞克隆形成率為(0.4057±0.016)%,4×105細(xì)胞組的胃癌干細(xì)胞克隆形成率為(0.213±0.413)%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。共培養(yǎng)體系下胃癌干細(xì)胞表達(dá)Caspase-3/9水平隨著巨噬細(xì)胞濃度的升高而升高,表現(xiàn)出胃癌干細(xì)胞凋亡的激活。MCP-1是最主要的趨化因子,對腫瘤的生長、侵襲以及新生血管的生成有重要作用,在巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)下,胃癌干細(xì)胞表現(xiàn)出MCP-1活性增強,提示在炎性環(huán)境下
5、干細(xì)胞有被激活的可能。COX-2是花生四烯酸代謝的關(guān)鍵限速酶,具有多種抗腫瘤凋亡途徑,可以降低介導(dǎo)凋亡的轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β的水平,限制細(xì)胞凋亡,有促進腫瘤生長的作用。共培養(yǎng)體系下胃癌干細(xì)胞高表達(dá)CoX-2,隨巨噬細(xì)胞濃度升高表現(xiàn)出更高的抗凋亡能力。于巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)體系下胃癌干細(xì)胞低表達(dá)COX-2下游的TGF-β,在炎性環(huán)境下抑制了TGF-β mRNA及蛋白的表達(dá)。共培養(yǎng)體系下隨巨噬細(xì)胞濃度升高,胃癌干細(xì)胞高表達(dá)PGE2 mRNA及蛋
6、白活性,抑制干細(xì)胞的凋亡,促進周圍血管生成。共培養(yǎng)體系下胃癌干細(xì)胞VEGF的mRNA及蛋白的表達(dá)被1×105、2×105/ml、4×105/ml的巨噬細(xì)胞顯著激活。腫瘤細(xì)胞和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞都可以分泌免疫抑制因子IL-10,IL-10可以促進巨噬細(xì)胞分化成M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞,抑制炎癥反應(yīng)、促進血管生成和組織修復(fù)。在與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)環(huán)境下胃癌干細(xì)胞表達(dá)IL-10活性減低。IL-4在胃癌患者血清中高表達(dá),IL-4與IL-10同樣在M2型
7、巨噬細(xì)胞高表達(dá),胃癌干細(xì)胞在與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)環(huán)境下低表達(dá)IL-4。IL-12對腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移具有抑制作用,M1型巨噬細(xì)胞高表達(dá)IL-12,在于巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)環(huán)境下胃癌干細(xì)胞高表達(dá)IL-12。在與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)環(huán)境下,胃癌干細(xì)胞雖然表達(dá)IL-4、IL-10與表達(dá)IL-12呈現(xiàn)雙向性,但總體反映了胃癌干細(xì)胞活性受到巨噬細(xì)胞的抑制。胃癌干細(xì)胞在巨噬細(xì)胞環(huán)境下高表達(dá)IFN-γ,表現(xiàn)出干細(xì)胞活性受到巨噬細(xì)胞抑制。MMP-2和MMP-9屬基質(zhì)金屬
8、蛋白酶,能夠影響細(xì)胞黏附分子,介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對宿主細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)降解,調(diào)控腫瘤新生血管的生成。胃癌干細(xì)胞在巨噬細(xì)胞影響低表達(dá)MMP-2和MMP-9,干細(xì)胞的侵襲性受到巨噬細(xì)胞抑制。
結(jié)論:胃癌干細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)體系下,雖然MTT實驗和干細(xì)胞克隆實驗中表現(xiàn)為胃癌干細(xì)胞受到巨噬細(xì)胞的抑制,共培養(yǎng)體系中Caspase-3/9、IL-4,IL-10、INF-γ受到激活、IL-12、MMP-2、MMP-9基質(zhì)金屬蛋白酶受到抑制;同時
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