骨髓間充質(zhì)干細胞與牙髓細胞共培養(yǎng)對細胞增殖、礦化及IL-1β分泌影響的研究.pdf

1、背景：牙髓病、根尖周病是造成牙體組織損傷的的常見病，在世界范圍內(nèi)均有較高的患病率。越來越多的基礎和臨床研究表明，牙體牙周損傷與全身健康有著密切的雙向關系。
　　干細胞是一類具有多向分化潛能及較強增殖能力的細胞，在一定條件下，它可以分化成多種功能的細胞。干細胞按照其來源可以分為胚胎干細胞和成體干細胞。2006年，日本學者通過轉(zhuǎn)染特定的基因組合將已分化的體細胞重編誘導產(chǎn)生一種新型多潛能干細胞，這種干細胞稱為誘導性多潛能干細胞。在牙齒再

2、生修復的研究領域，成體干細胞、胚胎干細胞和誘導性多潛能干細胞均已開始應用。
　　胚胎干細胞來源于胚胎發(fā)育期的胚泡，可以在體外長期保持未分化狀態(tài)，并具有分化為機體內(nèi)任何一種體細胞的潛能，而成體干細胞則來源于已經(jīng)發(fā)育成熟的組織，是一種多能干細胞或單能干細胞。
　　牙髓干細胞(dental pulp stem cells，DPSCs)是存在于牙髓細胞(dental pulpcells，DPCs)內(nèi)具有多向分化潛能及較強增殖能力的間

3、充質(zhì)干細胞，為廣泛應用于牙體缺損修復研究的牙源性成體干細胞。DPSCs在齲損與牙髓損傷情況下作為替代成牙本質(zhì)細胞的前體細胞，參與牙髓損傷修復。骨髓間充質(zhì)干細胞(bonemesenchymal stem cells，BMSCs)是一類非造血來源的具有多向分化能力的干細胞。由于其具有向多種中胚層和神經(jīng)外胚層來源的組織細胞分化的潛能，且具有來源損傷小、易恢復、易培養(yǎng)等優(yōu)勢，成為目前備受關注的干細胞。研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs生理狀態(tài)下具有定向遷移到

4、多種組織的能力，其遷移至損傷區(qū)的能力更強且具有促進損傷修復的功能。在牙髓損傷修復研究中，亦發(fā)現(xiàn)BMSCs具有參與牙髓牙周損傷修復的功能。亦有學者通過BMSCs移植證明其具有參與修復牙體、牙周組織缺損的能力。
　　干細胞的治療作用涉及干細胞的存活能力，調(diào)節(jié)微環(huán)境和旁分泌，動員和募集宿主自身的干細胞參與組織再生。間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的治療效果并不只是通過分泌具有生物活性的因子實現(xiàn)的，移

5、植的MSCs的另一個重要作用體現(xiàn)在其分化能力上。干細胞的定向分化為其發(fā)揮作用的重要方式，BMSCs可以根據(jù)其所處的環(huán)境主動轉(zhuǎn)化為相應類型的細胞。有研究指出干細胞的分化不僅涉及細胞所處的化學微環(huán)境，物理微環(huán)境對干細胞分化的影響也有著重要作用。
　　綜上所述，BMSCs這一具有促進牙髓及多種組織損傷修復能力的間充質(zhì)干細胞，可能通過物理接觸或者旁分泌方式對DPCs產(chǎn)生影響從而促進牙髓損傷修復，本實驗通過BMSCs與DPCs體外共培養(yǎng)，探

6、究兩者共培養(yǎng)的可行性及其對細胞生物學性能的影響，為BMSCs的臨床應用提供一定的理論依據(jù)。
　　目的：本研究通過體外共培養(yǎng)探究BMSCs與DPCs共存情況下對細胞生物學性能的影響，為牙齒組織工程學選擇合適的種子細胞及骨髓間充質(zhì)干細胞應用于臨床牙髓病治療提供理論依據(jù)。
　　材料與方法：
　　第一部分大鼠牙髓細胞的分離、培養(yǎng)
　　4w齡SD大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉腹腔麻醉后脫頸處死，75％酒精浸泡15min，超凈臺內(nèi)手術取出

7、下頜骨后浸泡于75％酒精5min，用含雙抗PBS溶液反復沖洗2-3遍洗凈酒精后剔除下頜骨表而肌肉組織。用鉗子夾碎硬組織，取出牙髓組織，剪除根尖1/3。將取得的牙髓組織剪成約0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm大小組織塊后用含雙抗的PBS溶液沖洗兩遍，3mg/mLⅠ型膠原酶，37℃恒溫振蕩搖床消化約10min，至組織松散接觸。加入少量培養(yǎng)液，輕輕吹打，800 rpm離心3min，棄上清，洗去膠原酶。用牙科探針將組織碎塊移入培養(yǎng)瓶內(nèi)，以

8、0.5cm間距均勻鋪于濕潤的培養(yǎng)瓶底，向瓶內(nèi)加入4mL含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，將培養(yǎng)瓶倒置，使組織塊與培養(yǎng)基暫不接觸，置于37℃、5％CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4h后輕輕翻瓶，3d常規(guī)換液。原代細胞生長融合至80％時，傳代培養(yǎng)。
　　第二部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定
　　4w齡SD大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉腹腔麻醉后脫頸處死，75％酒精浸泡消毒15min，超凈臺內(nèi)手術取出脛骨、股骨，用含雙抗PBS溶液反

9、復沖洗2-3遍后剔除骨表面軟組織。含雙抗的PBS反復沖洗脛骨股骨，剪開股骨、脛骨干骺端。注射器吸取DMEM/F12培養(yǎng)基反復沖洗骨髓腔以及干骺端，至骨干呈白色。洗出液800rpm離心3min，離心后棄上清，吸取含10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細胞，1mL皮試針反復吹吸混勻細胞后移入25cm2培養(yǎng)瓶，37℃、5％ CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。棄去半小時內(nèi)貼壁的細胞，將暫未貼壁的細胞移至另一培養(yǎng)瓶，24h首次換液，以后每3-4d更換培養(yǎng)

10、基。直到10d左右，細胞生長至約80％融合進行傳代培養(yǎng)。去除原培養(yǎng)基，用無菌PBS緩沖液緩慢沖洗三次，加入1mL0.25％含EDTA的胰酶消化1min左右，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化，當少量細胞變圓變亮即將慢慢脫離瓶底時，迅速加入2mL含10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，不吹打細胞，僅將已消化下來的細胞常規(guī)傳代培養(yǎng)，棄去原培養(yǎng)瓶中未消化下來的細胞。
　　重復上述傳代方法三次后，取第3代BMSCs，MTT法繪制細胞

11、生長曲線;流式細胞技術鑒定細胞的間質(zhì)干細胞表面標志物的表達情況;以3×105/孔密度接種在6孔板培養(yǎng)，待細胞生長密度達到80％后，加入DMEM/F12礦化誘導液（含10％FBS，0.1uM地塞米松，50uM維生素C，10mMβ-磷酸甘油），BMSCs礦化誘導14d后茜素紅染色，倒置顯微鏡下觀察成骨情況;以3×105/孔密度接種于6孔板中，待細胞生長密度達到80％后，更換為成脂誘導液（含10％胎牛血清的培養(yǎng)基加入1μM地塞米松，200μM

12、消炎痛，0.5mM IBMX，10μg/mL胰島素），隔3d換液。成脂誘導21d后，油紅O混合液染色，倒置顯微鏡下觀察脂滴的形成情況。
　　第三部分接觸式共培養(yǎng)對細胞增殖及礦化能力的影響
　　分別將第3代BMSCs和DPCs以及兩者1∶1比例混合細胞以5×103/孔的細胞量接種于96孔板，MTT法繪制細胞生長曲線比較接觸式培養(yǎng)對細胞增殖的影響。分別將第3代BMSCs、DPCs以及兩者1∶1比例混合細胞以3×105/孔密度接種

13、于6孔板中，待細胞生長密度達到80％后開始礦化誘導。誘導7d，14d后，收集提純各組總RNA，用qRT-PCR方法檢測OCN，OPN，ALP，DSPP等礦化相關基因在mRNA水平的表達。對經(jīng)誘導的各組細胞進行茜素紅染色觀察鈣結(jié)節(jié)形成情況。
　　第四部分接觸式共培養(yǎng)對細胞IL-1β分泌的影響
　　分別將BMSCs、DPCs及按1∶1比例混勻的混合細胞分為三組，以3×105/孔細胞密度接種于6孔板，接種后第3d細胞生長密度達到8

14、0％左右后，更換為含LPS濃度分別為10ng/mL、100ng/mL的含10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，陰性對照組不加LPS。將LPS刺激2h及對照組的細胞提取總RNA，進行qRT-PCR檢測共培養(yǎng)對LPS刺激情況下細胞炎癥相關因子表達的影響。
　　結(jié)果：1.成功分離培養(yǎng)大鼠牙髓細胞
　　改良組織塊酶消化法原代培養(yǎng)3d左右，便有細胞從牙髓組織塊周圍遷出。大鼠牙髓細胞光鏡下排列較為集中，形態(tài)以多邊形為主，邊緣處細胞生長較

15、為稀疏，內(nèi)部緊密處細胞較多。總體上細胞形態(tài)呈多角形，細胞成簇生長，胞質(zhì)豐富，細胞核圓，居中。傳代后細胞增殖較快，呈生長均勻的多角形、鋪路石樣細胞。
　　2.成功分離培養(yǎng)鑒定大鼠BMSCs
　　全骨髓貼壁法原代培養(yǎng)接種后鏡下可見大量大小不一呈圓形或類圓形混合細胞;24h后便有細胞開始貼壁，第4d左右可見明顯細胞克隆團塊形成;約10d左右，細胞密度達到80％左右融合時，可進行傳代培養(yǎng)。經(jīng)三次傳代后，細胞呈均一的長梭形，排列成漩渦

16、狀成纖維細胞樣形態(tài)，間雜少量亮圓形細胞，總體上細胞形態(tài)一致性增高。培養(yǎng)獲得的細胞具有良好的增殖能力及成骨、成脂能力。流式細胞標志物檢測發(fā)現(xiàn)，造血干細胞表面表達的標志物CD34、CD45為陰性，陽性率低于1％，間充質(zhì)干細胞表面標記物CD44、CD29、CD90均為陽性，雙峰。
　　3.體外接觸式共培養(yǎng)對細胞增殖及礦化能力的影響
　　兩種細胞以1∶1比例混勻接種，數(shù)小時后細胞貼壁良好，倒置顯微鏡下可見多角形細胞及長梭形細胞混合生

17、長，生長狀態(tài)良好。共培養(yǎng)組細胞增殖能力較單獨培養(yǎng)組明顯增強。qRT-PCR結(jié)果顯示，礦化誘導1w到2w各組細胞均表達RUNX2、ALP、OCN、OPN等礦化相關基因，且表達量隨著礦化時間的增長有增強趨勢。其中礦化誘導第二周，BMSCs的RUNX2、ALP、OCN表達量顯著升高，有顯著性差異(P＜0.05)?；旌霞毎MRUNX2、ALP未見明顯升高，但OCN、OPN表達顯著升高，且高于其余各組。礦化誘導培養(yǎng)14d后，DPCs表達牙源性礦化

18、相關基因DSPP顯著升高，混合細胞組有升高趨勢，但無統(tǒng)計學差異。
　　4.LPS刺激接觸式共培養(yǎng)的細胞對細胞IL-1β分泌的比較
　　qRT-PCR結(jié)果顯示，BMSCs、DPCs及共培養(yǎng)組各組細胞在LPS刺激下表達IL-1β，且隨著LPS劑量增加表達量增高。其中，DPCs組相對表達較低，混合細胞組表達量較高。
　　結(jié)論：1.運用改良組織塊酶消化法培養(yǎng)出原代大鼠DPCs，獲得的細胞具有較好增殖能力及良好礦化能力，為后續(xù)實

19、驗提供細胞學基礎。
　　2.本研究通過相對直接的分離培養(yǎng)方法，培養(yǎng)出有較旺盛增殖能力的貼壁細胞，所獲細胞的表型和生物學特性與BMSCs相符合，為后續(xù)實驗提供穩(wěn)定、可靠的細胞來源。
　　3.BMSCs與DPCs兩種細胞共培養(yǎng)可以在不減弱成牙能力的基礎上顯著提高細胞增殖力及礦化能力，從而促進組織損傷修復，為BMSCs促進牙髓組織再生提供基礎依據(jù)。
　　4.BMSCs與DPCs共培養(yǎng)可影響細胞的抗炎性能，具體作用方式及作用效