Ox-LDL與TGFβ1對(duì)共培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖與分化的影響.pdf

1、第一部分 SD大鼠MSCs、ECs的培養(yǎng) 目的:體外培養(yǎng)SD大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells MSCs)、主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(Endothelial Cells ECs)，為測(cè)定共培養(yǎng)細(xì)胞的增殖和MSCs的分化作準(zhǔn)備。 方法：MSCs的培養(yǎng)：無菌條件下取SD大鼠的股骨與脛骨，應(yīng)用PBS沖洗骨髓腔，將細(xì)胞混懸液以(3-5)×10<'6>/瓶的密度接種到75cm<'2>的培養(yǎng)瓶中，采取全骨髓貼

2、壁法培養(yǎng)SD大鼠的原代MSCs。48小時(shí)首次換液，將懸浮未貼壁細(xì)胞去掉。以后每三日換液一次，10-14天細(xì)胞生長達(dá)融合狀態(tài)時(shí)，應(yīng)用0.25％胰蛋白酶+0.01％EDTA進(jìn)行消化，以1：2的比例進(jìn)行傳代。通過換液與傳代純化MSCs。應(yīng)用流式細(xì)胞儀對(duì)P3代MSCs的CD34、CD90進(jìn)行鑒定。ECs的培養(yǎng)：無菌條件下取SD大鼠的胸主動(dòng)脈，清除血管外結(jié)締組織，將其剪成厚約1.5mm的血管環(huán)。以15-20個(gè)血管環(huán)/瓶的密度接種于25am<'2>

3、的培養(yǎng)瓶中，以20％胎牛血清的DMEM進(jìn)行培養(yǎng)。靜止培養(yǎng)60小時(shí)后首次換液去掉血管環(huán)，6-8天細(xì)胞達(dá)單層融合時(shí)應(yīng)用0.25％胰蛋白酶+0.01％EDTA進(jìn)行消化，以1：2的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。應(yīng)用ABC法對(duì)P3代細(xì)胞的Ⅷ因子進(jìn)行鑒定。 結(jié)果:MSCs原代培養(yǎng)48小時(shí)換液后，可見少量細(xì)胞貼壁生長，呈集落樣分布于培養(yǎng)瓶底部。換液后細(xì)胞呈紡錘形、長梭形生長。10-14天時(shí)，細(xì)胞呈成纖維狀鋪滿瓶底。傳代細(xì)胞生長加快，6-8天既可達(dá)單層融合

4、狀態(tài)。P3代細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定，CD34表達(dá)率為0.21％，CD90表達(dá)率為96.7％；ECs原代培養(yǎng)60小時(shí)后，細(xì)胞呈集落樣散在分布于培養(yǎng)瓶底部，6-8天即可達(dá)融合狀態(tài)，此時(shí)細(xì)胞呈現(xiàn)典型的‘鋪路石樣’形態(tài)。傳代細(xì)胞3天即可達(dá)單層融合狀態(tài)，P3代細(xì)胞經(jīng)ABC法鑒定其陽性率可達(dá)95％以上。 結(jié)論:實(shí)驗(yàn)所采用的細(xì)胞培養(yǎng)方法可行，細(xì)胞純度能夠達(dá)到實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的要求。 第二部分共培養(yǎng)體系的建立和細(xì)胞增殖與分化的測(cè)定 目的:

5、探討MSCs對(duì)聯(lián)合培養(yǎng)細(xì)胞增殖及自身表達(dá)平滑肌肌動(dòng)蛋白(smooth muscle alpha-actinα-actin SM)的影響。 方法:(1)建立MSCs和ECs增殖共培養(yǎng)體系：對(duì)P3-P5代的MSCs與ECs進(jìn)行消化離心，去除上清后加入適量培養(yǎng)基將細(xì)胞吹打混勻，應(yīng)用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。單純MSCs培養(yǎng)組以10000個(gè)細(xì)胞/孔加入24孔板中，共培養(yǎng)組MSCs與ECs以9000：1000個(gè)細(xì)胞/孔的比例加入24孔板中，

6、分別在1、2、3、4天對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞消化計(jì)數(shù)。每組每時(shí)間點(diǎn)計(jì)數(shù)6孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。(2)建立MSCs和ECs分化共培養(yǎng)體系：對(duì)P3-P5代的MSCs與ECs進(jìn)行消化離心，MSCs去掉上清后加入1ml培養(yǎng)基，吹打混勻，然后避光加入5ng的DAPI(4'6-diamidino-2-phenylindole 2hei 4'6'-二乙?；?2-苯基吲哚)，37℃避光孵育30min。單純MSCs培養(yǎng)組以10000個(gè)細(xì)胞/孔加入24孔板中，共培養(yǎng)組M

7、SCs與ECs以9000：1000個(gè)細(xì)且包/孔的比例加入24孔板中，孔底置蓋玻片，避光培養(yǎng)5天，利用抗α-actin SM熒光抗體，采用免疫組化方法檢測(cè)兩組中MSCs胞漿內(nèi)α-actin SM的表達(dá)。 結(jié)果:(1)共培養(yǎng)組細(xì)胞計(jì)數(shù)較單獨(dú)MSCs培養(yǎng)組減少，但兩組沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(2)單純MSCs培養(yǎng)組α-actin SM的陽性表達(dá)率為44.1％，共培養(yǎng)組MSCs表達(dá)α-actin SM的陽性率為23.6％，兩組間有

8、統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。 結(jié)論:(1)MSCs與ECs具有兼容性，能夠進(jìn)行直接共培養(yǎng)，且共培養(yǎng)對(duì)MSCs的增殖無明顯影響。(2)MSCs本身即可表達(dá)α-actin SM，與ECs共培養(yǎng)后α-actin SM表達(dá)受到抑制，表明與ECs共培養(yǎng)后可抑制MSCs向平滑肌樣細(xì)胞分化。 第三部分 Ox-LDL與TGFβ1對(duì)共培養(yǎng)的骨髓MSCs增殖和分化的影響 目的:探討氧化型低密度脂蛋白(Oxiddized low de

9、nsity lipoprotein Ox-LDL)轉(zhuǎn)化生長因子β1(Transforming growth factor-β1 TGFβ1)對(duì)與ECs共培養(yǎng)體系中MSCs增殖和向平滑肌樣細(xì)胞(Smooth Muscle CeHs SMCs)方向分化的影響。 方法:對(duì)P3-P5代的MSCs與ECs進(jìn)行消化離心，MSCs去掉上清后加人1ml培養(yǎng)基，吹打混勻，然后避光加入 5ng的DAPI，37℃避光孵育30min。將MSCs與ECs

10、以9000：1000個(gè)細(xì)胞/孔的比例加入內(nèi)置蓋玻片的24孔板中，試驗(yàn)分三組：?jiǎn)渭児才囵B(yǎng)組，不加干預(yù)因素；Ox-LDL干預(yù)組以5ug/mlOx-LDL進(jìn)行干預(yù)；TGFβ1干預(yù)組以5ng/ml的TGFβ1進(jìn)行干預(yù)。共培養(yǎng)細(xì)胞避光培養(yǎng)5天，利用抗α-actin SM熒光抗體，采用免疫組化方法檢測(cè)三組中MSCs胞漿內(nèi)α-actin SM的表達(dá)。利用Leica Qwin軟件，在熒光顯微鏡高倍視野下計(jì)數(shù)每組中DAPI標(biāo)記的細(xì)胞核數(shù)，測(cè)定細(xì)胞增殖情況

11、。 結(jié)果:(1)MSCs的α-actin SM的表達(dá)Ox-LDL(5ug/ml)干預(yù)組MSCs表達(dá)α-actin SM的陽性率約為9.9％，TGFl31(5ng/ml)干預(yù)組MSCs表達(dá)(α-actin SM的陽性率約為36.7％，在未干預(yù)組，MSCs表達(dá)α-actin SM的陽性率約為23.60％，干預(yù)組與對(duì)照組相比均P<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(2)未干預(yù)組細(xì)胞數(shù)為67.80±21.45/高倍視野，Ox-LDL(5ug/m

12、l)干預(yù)組細(xì)胞數(shù)為135.6±39.45/高倍視野，與對(duì)照組相比，MSCs細(xì)胞數(shù)明顯增高P<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；TGFβ1(Sng/ml)干預(yù)組MSCs數(shù)量為60.00±20.38/高倍視野，與對(duì)照組相比，MSCs細(xì)胞數(shù)雖有所減少，但P>0.05，兩組間的增殖無明顯差異。 結(jié)論：Ox-LDL(5ug/ml)具有促進(jìn)共培養(yǎng)中MSCs增殖，降低MSCs向平滑肌細(xì)胞方向分化，而TGFβ1(Sng/ml)具有促進(jìn)共培養(yǎng)體系中MSC