內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液對(duì)肝癌細(xì)胞癌干細(xì)胞表型及肝癌干細(xì)胞遷移的影響.pdf

1、癌癥是威脅人類健康的最嚴(yán)重疾病之一。世界各國(guó)常見腫瘤的死亡率前3位依次是肺癌、胃癌和肝癌。肝癌不僅死亡率高，且近年來(lái)發(fā)病率也在不斷上升，對(duì)肝癌的治療和預(yù)防以及相關(guān)機(jī)理探索一直是腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。目前治療肝癌的主要手段有外科手術(shù)切除、放射治療、抗癌化學(xué)藥物治療、肝移植等，但這些方法還不能解決其復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移問題，肝癌的治療仍然是臨床科學(xué)家們面臨的挑戰(zhàn)。
　　近年研究表明，惡性腫瘤是來(lái)源于數(shù)量微小、具有自我更新和多分化潛能的癌干細(xì)胞（C

2、SCs）。CSCs被認(rèn)為是維系腫瘤起始和生長(zhǎng)以及形成不同分化程度癌細(xì)胞及預(yù)后不良的根源，在癌癥復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中起決定作用。癌干細(xì)胞學(xué)說的提出為癌癥的治療帶來(lái)了新的曙光，CSCs靶向干預(yù)成為癌癥治療的全新策略。
　　內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）是血管壁的重要組成成分，也是腫瘤微環(huán)境的重要組成成分。有研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間的交互對(duì)話對(duì)于促進(jìn)CSCs表型、增強(qiáng)腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移可能起著重要調(diào)節(jié)作用。肝臟是富含血管的組織，在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中，內(nèi)皮細(xì)胞

3、參與構(gòu)建的腫瘤微環(huán)境是否促進(jìn)肝癌細(xì)胞CSCs表型？是否影響肝癌干細(xì)胞（LCSCs）的遷移行為？這些問題目前還不清楚。為此，本文主要考察了內(nèi)皮細(xì)胞微環(huán)境對(duì)肝癌細(xì)胞CSCs表型以及LCSCs遷移行為的影響。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：
　?、賰?nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液（EC-CM）對(duì)肝癌細(xì)胞CSCs表型的影響
　　分別培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和人肝癌細(xì)胞MHCC97H，收集EC-CM與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測(cè)EC-CM對(duì)人肝癌細(xì)胞藥物敏感性、克隆形

4、成能力、成球能力、遷移能力、侵襲能力以及癌干細(xì)胞表面標(biāo)志物CD133表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EC-CM能顯著提高 MHCC97H細(xì)胞對(duì)抗癌藥物順鉑和五氟尿嘧啶的藥物抵抗能力，增強(qiáng)MHCC97H細(xì)胞的克隆形成能力和腫瘤球形成能力。Transwell實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)EC-CM不僅增強(qiáng)MHCC97H細(xì)胞的遷移能力和侵襲基底膜的能力，而且上調(diào)LCSCs標(biāo)志物CD133的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EC-CM能夠促進(jìn)MHCC97H細(xì)胞的癌干細(xì)胞表型。<

5、br>　?、贚CSCs的分選和鑒定
　　采用體外腫瘤球培養(yǎng)法進(jìn)行LCSCs的分選。將MHCC97H細(xì)胞進(jìn)行無(wú)血清懸浮培養(yǎng)，每隔5-6天進(jìn)行傳代。利用第三代球體細(xì)胞進(jìn)行藥物敏感性、克隆形成能力的檢測(cè)以及肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物CD133，CD44，Oct3/4的檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過體外腫瘤球分選法獲得的球體細(xì)胞與MHCC97H細(xì)胞相比具有顯著的癌干細(xì)胞特征。球體細(xì)胞對(duì)不同濃度的抗癌藥物順鉑和五氟尿嘧啶表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐藥性。球體細(xì)胞與MHCC9

6、7H細(xì)胞相比具有更強(qiáng)的克隆形成能力。流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)球體細(xì)胞與MHCC97H細(xì)胞相比癌干細(xì)胞標(biāo)志物CD133，Oct3/4)的表達(dá)明顯升高。這些結(jié)果表明，通過體外腫瘤球分選法富集的球體細(xì)胞是不同于MHCC97H細(xì)胞的亞群，具有CSCs特征。
　?、跡C-CM對(duì)LCSCs遷移行為的影響。
　　采用Transwell考察了EC-CM作用下LCSCs遷移行為的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EC-CM能夠顯著促進(jìn)LCSCs的遷移能力。進(jìn)一步通過

7、免疫熒光染色觀察了EC-CM作用下LCSCs細(xì)胞骨架F-actin的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EC-CM可能通過降低LCSCs中F-actin的表達(dá)。原子力顯微鏡結(jié)果顯示EC-CM作用LCSCs后細(xì)胞的楊氏模量降低。結(jié)果提示EC-CM可能通過減少F-actin的表達(dá)來(lái)降低LCSCs硬度，從而提高LCSCs的運(yùn)動(dòng)、變形能力，促進(jìn)LCSCs的遷移。
　　本文的研究結(jié)果表明，內(nèi)皮細(xì)胞微環(huán)境能夠促進(jìn)MHCC97H細(xì)胞的癌干細(xì)胞表型，通過改變細(xì)胞骨架