Nanog陽性肝癌細胞在肝癌干細胞層級分化中的地位與作用研究.pdf

1、中國作為肝癌的重災(zāi)區(qū)，肝癌研究的任務(wù)艱巨，盡管近年來手術(shù)、放化療等多種治療手段在不斷進步，但肝癌患者的5年生存率仍然很低。隨著人們對腫瘤研究的深入推進，大量研究指向腫瘤干細胞的存在是腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵，找到并研究腫瘤干細胞賴以維持的條件，進而開發(fā)針對性的治療手段成為腫瘤學(xué)研究的一個重要方向，肝癌干細胞研究也因此被寄予厚望。
　　與黑色素瘤、乳腺癌等具有較為明確的腫瘤干細胞標記物不同，在本課題開展之前，多個研究小組已陸續(xù)建立了以C

2、D133、EpCAM、CD90、CD13和CD24等為標記物的肝癌干細胞模型，并且在課題開展過程中新的標記物仍在不斷涌現(xiàn)。之所以有如此多的肝癌干細胞模型出現(xiàn)，其中的一個重要原因是這些標記物在各研究小組之間研究結(jié)果的不一致甚至是難以重復(fù)。提示這些標記物對于特定研究條件的依賴，也一定程度上反應(yīng)了這些標記物自身的不穩(wěn)定性。而這種肝癌干細胞研究看似表面上的百花齊放，在實質(zhì)上已經(jīng)阻礙了對其更深層次機制研究的繼續(xù)推行。
　　然而，縱然有這些肝

3、癌干細胞標記物和肝癌干細胞模型的存在，但實質(zhì)不變的是，這些肝癌干細胞的維持都依賴于細胞內(nèi)的干性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。因此本研究從腫瘤干細胞與胚胎干細胞的相似性入手，以胚胎干細胞自我更新維持的核心分子Nanog為標記，建立了一套全新的肝癌干細胞分選模型，并圍繞其生物學(xué)特性、自我更新機制以及與其他肝癌干細胞標記物之間的相互關(guān)系展開研究。在此基礎(chǔ)上，我們進一步對課題研究過程中發(fā)現(xiàn)的肝癌干細胞標記物自身及相互間轉(zhuǎn)化的新現(xiàn)象及其發(fā)生機制進行了探討。
　

4、　本文的主要研究方法、研究結(jié)果如下:
　　1.證明了Nanog可以作為肝癌干細胞的新標記物分子
　　(1)證明Nanog可以作為肝癌預(yù)后的標記物。Western Blot證明Nanog在肝癌組織中相對癌旁組織高表達;IHC檢測了Nanog在59例肝癌組織的表達水平，分析顯示Nanog表達水平與肝癌臨床復(fù)發(fā)以及包膜和血管浸潤顯著相關(guān)，Kaplan-Meier生存曲線分析顯示Nanog與患者總生存期和無病生存期顯著相關(guān)。(2)構(gòu)

5、建了由Nanog啟動子驅(qū)動的熒光報告系統(tǒng)。完成Nanog啟動子驅(qū)動的GFP報告慢病毒系統(tǒng)的構(gòu)建，經(jīng)驗證被病毒感染的細胞中，GFP的表達強度可以反映內(nèi)源Nanog的表達水平。(3)證明Nanog陽性細胞具有更強的自我更新能力。實驗結(jié)果顯示Nanog陽性細胞具有更強的細胞球形成、克隆形成、體內(nèi)成瘤以及多向分化能力。(4)證明Nanog陽性細胞具有高侵襲、強耐藥以及慢增殖的特性。Transwell實驗證明Nanog陽性細胞具有更強的侵襲和遷移

6、能力，蛋白水平檢測證明Nanog陽性細胞表現(xiàn)出EMT特征，體內(nèi)轉(zhuǎn)移實驗證明Nanog陽性細胞具有更強的轉(zhuǎn)移能力;細胞殺傷實驗證明Nanog陽性細胞對肝癌化療藥物Sorafenib以及順鉑具有更強的抵抗特性，RNA水平檢測證明Nanog陽性細胞高表達多個耐藥基因;免疫熒光染色證明Nanog強陽性細胞中Ki67標記陽性率較低，單細胞增殖實驗表明Nanog強陽性細胞增殖較慢。
　　2.明確了Nanog陽性肝癌干細胞的自我更新機制

7、　　(1)證明Nanog是維持肝癌干細胞自我更新的必要分子。慢病毒RNA干擾試驗顯示干擾Nanog的表達可顯著降低細胞的細胞球形成能力、克隆形成能力以及遷移能力，并導(dǎo)致細胞中干細胞相關(guān)基因Oct4和Sox2表達下調(diào)而成熟肝細胞標記物AFP、CK8、CK18、TTR表達上調(diào)。成瘤實驗表明在Nanog陰性細胞中過表達Nanog，可明顯提升其成瘤能力，Transwell實驗顯示過表達后細胞的遷移能力顯著增強。(2)發(fā)現(xiàn)IGF信號通路在Nano

8、g陽性細胞中激活。全基因表達譜分析顯示IGF信號通路多個分子在Nanog陽性細胞中高表達，進一步qRT-PCR驗證表明IGF2及其受體IGF1R在陽性細胞中顯著上調(diào)。(3)證明Nanog可以調(diào)控IGF1R的表達水平。Western Blot實驗證明在Nanog陽性細胞中干擾Nanog可以導(dǎo)致IGF1R下調(diào)，反之在Nanog陰性細胞中過表達Nanog則引起IGF1R表達上調(diào)。ChIP實驗證明Nanog可以結(jié)合到IGF1R啟動子，提示Nan

9、og可能通過激活I(lǐng)GF1R轉(zhuǎn)錄從而上調(diào)其表達。(4)證明IGF信號可調(diào)控細胞的自我更新能力以及Nanog的表達。實驗結(jié)果顯示IGF1R抑制劑PPP和AEW541處理可以顯著降低細胞的細胞球形成能力，并同時顯著下調(diào)Nanog的RNA水平。
　　3.明晰了肝癌干細胞6種標記物在肝癌中的分布概況及相關(guān)性
　　(1)明確了肝癌細胞中6種肝癌干細胞標記物的表達概況。通過流式細胞術(shù)對3種肝癌細胞系和5種肝癌原代細胞中的CD133、EpC

10、AM、CD90、CD24、CD13以及Nanog總計6種肝癌干細胞標記物的表達進行檢測，發(fā)現(xiàn)CD13和CD24在多數(shù)細胞中呈高表達、CD133和EpCAM表達在細胞中異質(zhì)性較大、Nanog表達穩(wěn)定在10％左右、而除SMCC-7721細胞以外CD90在所檢細胞中幾乎不表達。(2)發(fā)現(xiàn)肝癌細胞可區(qū)分為高自我更新能力和低自我更新能力兩類。通過克隆形成、細胞球形成以及體內(nèi)成瘤能力檢測，發(fā)現(xiàn)三種能力在所檢的8種肝癌細胞中存在顯著差異，并且可以由此

11、將細胞明顯區(qū)分為高低自我更新能力兩類。(3)發(fā)現(xiàn)CD133和EpCAM的表達水平可以區(qū)分高低自我更新能力的兩類細胞。通過對高低自我更新能力的兩類肝癌細胞中6種標記物的表達情況進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)CD133和EpCAM在高自我更新的肝癌細胞中比例顯著高于在低自我更新細胞中的相應(yīng)比例。(4)建立和應(yīng)用了6種肝癌干細胞共標記的方法。通過使用標記不同熒光的干細胞標記物，共同標記細胞，通過調(diào)整熒光補償可以將幾類標記明顯區(qū)分，繼而利用該方法完成了8種

12、肝癌細胞6種不同熒光共標記的檢測。(5)分析發(fā)現(xiàn)肝癌細胞中肝癌干細胞標記物的表達存在有限的特征組合，建立了肝癌中6種干細胞標記物的分布概況圖?；谏鲜?種熒光共標記檢測結(jié)果，分析顯示所檢的8種肝癌細胞的細胞主體均分布在有限的標記組合中，進一步通過對6種標記物兩兩間的重疊與包含情況的分析，我們描繪了肝癌中6種干細胞標記物的分布概況圖。
　　4.建立了基于Nanog和CD133為標記的肝癌干細胞層級分化模型
　　(1)分析發(fā)現(xiàn)C

13、D133是高豐度干細胞標記物中對肝癌細胞自我更新能力區(qū)分最好的標記。通過對不同自我更新能力的肝癌細胞中6種肝癌干細胞共標記數(shù)據(jù)進行分析，確定CD133是高豐度標記物中對高低自我更新能力的細胞區(qū)分度最好的標記分子。(2)發(fā)現(xiàn)Nanog相比CD133，對自我更新能力的指示作用更“顯性”?？寺⌒纬珊统汕蚰芰z測顯示，兩個標記中當Nanog標記為陽性時，無論細胞的CD133表達陽性或者陰性，均表現(xiàn)出更強的自我更新能力。(3)建立了基于CD133

14、和Nanog雙標記的肝癌干細胞層級分化模型。通過細胞群體和單細胞分化兩種方法檢測雙標記細胞中細胞的分化方向，結(jié)果顯示Nanog標記的細胞存在由強到弱、由陽到陰的單向性分化，而CD133標記的陰陽以及強弱細胞間可以相互轉(zhuǎn)化。進一步結(jié)合細胞的成球能力檢測，確定該模型中細胞的分化方向為 NanogHigh CD133Low/Neg到 NanogHighCD133High到NanogLowCD133Pos/Neg再到NanogNegCD133P

15、os最終到NanogNegCD133Neg。
　　5.闡明了肝癌干細胞6種標記物自身及相互間的轉(zhuǎn)化情況
　　(1)證明肝癌細胞干細胞標記物存在自發(fā)轉(zhuǎn)變。利用流式細胞儀將6種肝癌干細胞標記物的陰陽細胞分開，并分別進行群體和單細胞克隆培養(yǎng)。復(fù)檢結(jié)果顯示在6種肝癌干細胞標記物中CD133、CD13和CD24三種標記物陰性和陽性細胞間轉(zhuǎn)變較為明顯。其他標記中，CD90陰性細胞轉(zhuǎn)變?yōu)镃D90陽性細胞的概率較低;EpCAM陽性細胞則表現(xiàn)

16、出兩種狀態(tài)，在Huh7細胞中EpCAM陽性和陰性細胞間幾乎不轉(zhuǎn)化，而在T1224中則傾向于向EpCAM陽性狀態(tài)轉(zhuǎn)化;Nanog則表現(xiàn)為陽性到陰性的單向轉(zhuǎn)化。(2)證明肝癌干細胞標記的轉(zhuǎn)變不依賴于細胞分裂。使用4mM的丁酸鈉處理將細胞阻斷在G0/G1期后，肝癌干細胞表面標記物陰性與陽性細胞間的轉(zhuǎn)化仍會發(fā)生。(3)發(fā)現(xiàn)肝癌干細胞表面標記物間存在相互轉(zhuǎn)變。對肝癌干細胞的6種標記物進行兩兩雙標記進而體外培養(yǎng)并復(fù)測這些標記物的表達改變，發(fā)現(xiàn)Nan

17、og以外的5種表面標記物中除CD90，其他表面標記分子均存在相互間自發(fā)轉(zhuǎn)變;與此不同，我們發(fā)現(xiàn)Nanog陽性細胞具有向其他標記分子陽性細胞的單向轉(zhuǎn)變能力，即Nanog陽性細胞可以產(chǎn)生其余5種標記的陽性細胞，反之這些標記物陽性但Nanog陰性的細胞在常規(guī)條件下均無法轉(zhuǎn)變產(chǎn)生Nanog陽性細胞。(5)繪制了肝癌干細胞標記物自身及相互間的轉(zhuǎn)化關(guān)系圖。通過總結(jié)上述Huh7細胞中各種標記物的自身及相互間轉(zhuǎn)化的數(shù)據(jù)，得到了這些標記物的轉(zhuǎn)化關(guān)系圖。<

18、br>　　6.初步探明了Nanog陰性細胞在體內(nèi)特定條件下逆轉(zhuǎn)的條件及其分子機制
　　(1)發(fā)現(xiàn)Nanog陰性細胞可以在體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)镹anog陽性細胞。在Nanog陰性細胞體內(nèi)所成腫瘤中可檢出有GFP熒光出現(xiàn)，將其中的GFP陽性和陰性細胞分離出來后進行成瘤、克隆形成和成球?qū)嶒灳砻髂孓D(zhuǎn)得到的是有功能的Nanog陽性細胞。(2)證明Matrigel可以誘導(dǎo)Nanog陰性細胞逆轉(zhuǎn)。在體外條件下，Nanog陰性細胞用Matrigel培養(yǎng)，

19、可以產(chǎn)生Nanog陽性細胞，并且證明逆轉(zhuǎn)得到的陽性細胞比陰性細胞具有更強的成球能力。(3)證明Nanog陰性細胞逆轉(zhuǎn)是其體內(nèi)成瘤的重要先決條件。構(gòu)建了Nanog攜帶自殺基因TK的慢病毒載體Lv-NTPF以及對照載體Lv-NGPF，Western Blot和流式檢測證明該系統(tǒng)可以有效清除Nanog陽性細胞;使用上述系統(tǒng)清除Nanog陽性細胞后，細胞的克隆形成、成球以及成瘤能力均顯著降低;小鼠體內(nèi)實驗進一步證明，在加入TK底物GCV的情況下

20、，攜帶Lv-NTPF的細胞難以起始腫瘤，撤除GCV藥物后腫瘤生長得到恢復(fù)。(4)發(fā)現(xiàn)Matrigel中的Laminin成分是誘導(dǎo)Nanog陰性細胞逆轉(zhuǎn)的重要因素。體內(nèi)成瘤實驗發(fā)現(xiàn)生長因子減少的Matrigel與常規(guī)Matrigel具有相同的促成瘤作用，提示誘導(dǎo)逆轉(zhuǎn)的因素應(yīng)在兩者共同的基質(zhì)成分中;體外分別使用Matrigel的兩種主要基質(zhì)成分Collagen I和Laminin-1作為支撐成分，進行Nanog陰性細胞的逆分化研究，發(fā)現(xiàn)其中

21、Laminin-1可以在體外連續(xù)培養(yǎng)的條件下誘發(fā)陰性細胞逆轉(zhuǎn)。(5)發(fā)現(xiàn)Erk/STAT3信號通路可能參與Nanog陰性細胞的逆轉(zhuǎn)。Western Blot檢測顯示Erk在Nanog陰性細胞中的磷酸化水平高于陽性細胞，且陽性細胞分化后Erk磷酸化水平也上升，而STAT3則表現(xiàn)恰恰相反;Western Blot進一步也證明Matrigel和Laminin可誘導(dǎo)Nanog陰性細胞中的Erk和STAT3的磷酸化狀態(tài)向Nanog陽性細胞相同的方

22、向轉(zhuǎn)變。
　　綜上所述，本研究的主要結(jié)論是:
　　1.Nanog可以作為肝癌干細胞的新標記物，其可與IGF信號形成正反饋調(diào)節(jié)通路，調(diào)控肝癌干細胞的自我更新。
　　2.Nanog和CD133能很好的指示和區(qū)分肝癌細胞的自我更新能力，在以二者為基礎(chǔ)建立的肝癌干細胞分化模型中，Nanog處在分化層級的較頂端。
　　3.Nanog陰性細胞在體內(nèi)可以逆轉(zhuǎn)為陽性細胞，在體外可以通過添加Matrigel模擬這種轉(zhuǎn)變，而Matr