BMP-4對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞與神經(jīng)干細胞共培養(yǎng)轉(zhuǎn)歸影響的實驗研究.pdf

1、目的：探索骨形態(tài)生發(fā)蛋白4（BMP-4）對經(jīng)過與大鼠骨髓間充干細胞（MSCs）共同培養(yǎng)后的大鼠神經(jīng)干細胞(NSCs)的分化和存活的影響，為細胞移植治療脊髓損傷提供進一步的理論依據(jù)。
　　方法：提取新生24小時以內(nèi)SD大鼠的幼鼠的大腦組織，采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)7天，與從SD大鼠股骨骨髓中提取并經(jīng)貼壁梯度培養(yǎng)后的骨髓間充質(zhì)干細胞建立MSCs與NSCs共培養(yǎng)模型，在共同培養(yǎng)體系中加入BMP-4，利用流式細胞儀檢測經(jīng)Annexin V凋亡

2、試劑盒處理后NSCs的存活率，使用細胞免疫熒光染色技術(shù)對分化后的 NSCs進行免疫熒光染色并統(tǒng)計 NSCs分化后的特異性蛋白 MBP表達陽性的少突膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元特異性蛋白MAP-2及特異性蛋白GFAP表達陽性的星形膠質(zhì)細胞的表達情況。然后提取分化后細胞的總蛋白，行Western blot免疫印跡法鑒定 NSCs分化后的少突膠質(zhì)細胞特異性蛋白 MBP、星形膠質(zhì)細胞GFAP及神經(jīng)元特異性蛋白MAP-2的表達情況，計算NSCs的存活率和分化

3、率，進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析后明確BMP-4對共培養(yǎng)后NSCs的存活及分化的影響。
　　結(jié)果：（1）原代培養(yǎng)三代后的骨髓間充質(zhì)干細胞可見貼壁細胞呈梭形、螺旋狀，形態(tài)大體一致，原代培養(yǎng)的神經(jīng)干細胞可見大量懸浮生長的神經(jīng)干細胞球，經(jīng)過共同培養(yǎng)后神經(jīng)干細胞可定向分化為少突膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞及神經(jīng)元細胞。（2）利用H2O2制作細胞凋亡模型，將共培養(yǎng)后的神經(jīng)干細胞分為4組分別為空白對照組、H2O2組、H2O2+共培養(yǎng)組及H2O2+共培養(yǎng)+BMP

4、-4組。各組均采用Annexin V-PI細胞凋亡試劑盒，利用流式細胞術(shù)測定誘導(dǎo)凋亡后的神經(jīng)干細胞的存活率。經(jīng)流式細胞術(shù)檢測分析可見共培養(yǎng)后的神經(jīng)干細胞存活率明顯提高，但在共培養(yǎng)體系中加入BMP-4后細胞存活率出現(xiàn)一定程度的下降，經(jīng)方差分析顯示，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=29.373，P<0.05）（3）BMSCs與NSCs共培養(yǎng)后分為兩組即空白對照組和BMP-4組，培養(yǎng)7天后可見細胞形態(tài)上已出現(xiàn)了明顯的分化，光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)示細胞球向周邊呈

5、放射狀生長，細胞間交織緊密，細胞間隙較窄。細胞免疫熒光染色可見 GFAP陽性的星形膠質(zhì)細胞、MAP-2表達陽性的神經(jīng)元細胞以及 MBP表達陽性的少突膠質(zhì)細胞（4）提取細胞分化后的總蛋白，測定蛋白濃度后確定WB的上樣量測定神經(jīng)干細胞分化后GFAP、MAP-2、MBP的表達量，統(tǒng)計數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)實驗組中 GFAP的表達量高于對照組（t=9.638,P<0.05），MBP的表達量明顯低于對照組(t=4.902,P<0.05)，MAP-2的表達無明顯