巨噬細(xì)胞功能極化的組蛋白二價(jià)修飾調(diào)控.pdf

1、研究背景及意義
　　巨噬細(xì)胞廣泛分布于全身各個(gè)組織和器官,在保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、機(jī)體防御、炎癥調(diào)控、促進(jìn)損傷修復(fù)等方面起著重要作用。巨噬細(xì)胞雖被認(rèn)為是終末分化細(xì)胞,但研究表明其有一定的自我增殖能力和分化潛能,巨噬細(xì)胞在體內(nèi)炎癥刺激下可轉(zhuǎn)化為淋巴內(nèi)皮樣細(xì)胞,而在體外可轉(zhuǎn)化為血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和成肌纖維細(xì)胞。另外,巨噬細(xì)胞在不同微環(huán)境下可激活分化為不同的功能表型,且在合適條件下還可發(fā)生重分化,具有較強(qiáng)的可塑性。巨噬細(xì)胞在不同微環(huán)境下

2、呈現(xiàn)不同功能表型的特點(diǎn),使其在機(jī)體不同生理、病理?xiàng)l件下能夠發(fā)揮不同的功能,與腫瘤、代謝綜合癥等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。
　　靜息巨噬細(xì)胞在不同微環(huán)境下可激活分化為表型和功能迥異的兩大類型:炎癥型巨噬細(xì)胞和抗炎型巨噬細(xì)胞,又稱M1巨噬細(xì)胞和M2巨噬細(xì)胞。M1巨噬細(xì)胞由γ-IFN或γ-IFN和LPS等誘導(dǎo),誘發(fā)Th1型免疫應(yīng)答,起著防御細(xì)菌感染、加重炎癥反應(yīng)導(dǎo)致組織損傷的作用。M2巨噬細(xì)胞由IL-4或IL-4和IL-13等誘導(dǎo),

3、雖然由于激活條件的不同,還可以細(xì)分為M2a、M2b、M2c三種亞群,主要誘導(dǎo)Th2型免疫反應(yīng),防御寄生蟲感染,促進(jìn)組織修復(fù)和減輕或調(diào)控炎癥免疫應(yīng)答。研究發(fā)現(xiàn),M1和M2巨噬細(xì)胞在一定微環(huán)境下可分別重分化為M2樣和M1樣巨噬細(xì)胞,具有較大的可塑性。在動(dòng)脈粥樣硬化和Ⅱ型糖尿病動(dòng)物模型中,M2巨噬細(xì)胞可原位向M1樣表型轉(zhuǎn)化。而在腫瘤動(dòng)物模型中,則觀察到在外源性IL-12的作用下,M2樣表型的腫瘤細(xì)胞可轉(zhuǎn)變?yōu)镸1樣表型,同時(shí)體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí),M1

4、和M2巨噬細(xì)胞在分別適合M2和M1分化的條件下孵育時(shí),細(xì)胞呈現(xiàn)出M2樣和M1樣巨噬細(xì)胞的特性。
　　功能分化巨噬細(xì)胞的重分化與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān),在Ⅱ型糖尿病的發(fā)生中,正常機(jī)體脂肪組織巨噬細(xì)胞為分泌精氨酸酶-1的M2樣表型,但是隨著機(jī)體肥胖程度的增加,脂肪組織巨噬細(xì)胞由M2型向M1樣表型轉(zhuǎn)化,可分泌TNF-α、IL-6、iNOS等炎癥因子等,干擾脂肪細(xì)胞胰島素的正常信號(hào)通路,導(dǎo)致胰島素抵抗而誘導(dǎo)Ⅱ型糖尿病。類似的,在動(dòng)脈

5、粥樣硬化癥中,病變部位巨噬細(xì)胞由M2型向M1樣特性轉(zhuǎn)變,也與病情的進(jìn)展密切相關(guān)。而在腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中,受腫瘤微環(huán)境的影響,腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞由具有腫瘤殺傷活性的M1樣表型向M2樣表型轉(zhuǎn)化,可抑制機(jī)體免疫反應(yīng),促進(jìn)腫瘤新生血管生成和腫瘤基質(zhì)的重塑,最終促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。因此,對(duì)巨噬細(xì)胞功能極化可塑性機(jī)制的研究具有重要的意義,同時(shí),對(duì)該過程機(jī)制的研究可以深化我們對(duì)細(xì)胞尤其是免疫細(xì)胞適應(yīng)不同微環(huán)境機(jī)理機(jī)制的認(rèn)識(shí),為多種疾病的治療提供重要的

6、理論依據(jù)。
　　研究方法
　　1、體外誘導(dǎo)培養(yǎng)小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞,并運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞的純度。
　　2、脂多糖(LPS)和白介素-4(IL-4)分別誘導(dǎo)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞向M1巨噬細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞極化,采用RealtimePCR技術(shù)檢測(cè)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞在不同功能狀態(tài)(M1和M2)下,特定標(biāo)記基因TNF-α、IL-6、Arginase、Fizz-1、MCP-1、MRmRNA

7、的表達(dá),及調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的轉(zhuǎn)錄因子CEBPδ、PPARγ、IRF4、IRF5mRNA的表達(dá)。
　　3、體外培養(yǎng)小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞,運(yùn)用脂多糖(LPS)和白介素-4(IL-4)在優(yōu)化條件下分別將原代骨髓來源巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)極化為M1巨噬細(xì)胞和M2巨噬細(xì)胞。采用RealtimePCR技術(shù)檢測(cè)原代骨髓來源巨噬細(xì)胞中TNF-α、IL-6、Arginase、Fizz-1、IL-1β、iNOS、MR及轉(zhuǎn)錄因子CEBPδ、PPARγ、IRF4

8、mRNA水平的表達(dá)。
　　4、采用CCK-8試劑盒檢測(cè)不同濃度的組蛋白去乙?；敢种苿㏕richostatin(TSA)和DNA去甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2-脫氧胞(Aza)對(duì)小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞增殖能力的影響。脂多糖(LPS)誘導(dǎo)原代巨噬細(xì)胞向M1巨噬細(xì)胞極化,在極化過程中分別加入Trichostatin(TSA)、5-氮雜-2-脫氧胞(Aza)。白介素-4(IL-4)誘導(dǎo)原代巨噬細(xì)胞向M2巨噬細(xì)胞極化,在此過程中分別加入T

9、richostatin(TSA)、5-氮雜-2-脫氧胞(Aza)。采用RealtimePCR技術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞中TNF-α、IL-6、Arginase、Fizz-1mRNA水平的表達(dá)變化。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1、本研究中,不斷改進(jìn)骨髓來源巨噬細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法。小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞的FITC-F4/80陽性率達(dá)到了98.6％,APC-CD11b陽性率達(dá)到了98.2%,雙陽性率為98.1%,即巨噬細(xì)胞的純度為98.1%。

10、　　2、脂多糖(LPS)和白介素-4(IL-4)在不同時(shí)間條件下誘導(dǎo)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞向M1、M2巨噬細(xì)胞極化。LPS體外刺激巨噬細(xì)胞8h,M1巨噬細(xì)胞特定標(biāo)記基因TNF-α、IL-6mRNA水平的表達(dá)最高,巨噬細(xì)胞表現(xiàn)最顯著的M1功能表型。IL-4體外刺激小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞24h,M2巨噬細(xì)胞特定標(biāo)記基因Arginase、Fizz-1mRNA水平的表達(dá)最高,此時(shí)巨噬細(xì)胞表現(xiàn)最強(qiáng)的M2功能表型。
　　3、小鼠骨

11、髓來源巨噬細(xì)胞在優(yōu)化條件下分別極化為M1、M2巨噬細(xì)胞,表現(xiàn)出顯著的M1、M2功能表型。當(dāng)體外刺激條件改變時(shí),M1、M2巨噬細(xì)胞均可發(fā)生重分化。M1細(xì)胞重分化為M2樣巨噬細(xì)胞,M2細(xì)胞重分化為M1樣巨噬細(xì)胞,TNF-α、IL-6、Arginase、Fizz-1、IL-1β、MRmRNA的表達(dá)也發(fā)生相應(yīng)改變。
　　4、50nmol/L的Trichostatin(TSA)、1μmol/L的5-氮雜-2-脫氧胞(Aza)對(duì)原代骨髓來源巨

12、噬細(xì)胞增殖的抑制率最小。在M1巨噬細(xì)胞極化過程中分別加入50nmol/L的Trichostatin(TSA)、1μmol/L的5-氮雜-2-脫氧胞(Aza)。同時(shí),在M2巨噬細(xì)胞極化過程中也分別加入50nmol/L的Trichostatin(TSA)、1μmol/L的5-氮雜-2-脫氧胞(Aza)。結(jié)果顯示:M1、M2巨噬細(xì)胞中特定標(biāo)記基因TNF-α、IL-6、Arginase、Fizz-1mRNA的表達(dá)明顯增加。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論<

13、br>　　1、脂多糖(LPS)和白介素-4(IL-4)在不同時(shí)間條件下刺激巨噬細(xì)胞,使巨噬細(xì)胞獲得不同的功能表型。LPS體外刺激巨噬細(xì)胞8h,使巨噬細(xì)胞獲得最顯著的M1表型,而IL-4體外刺激巨噬細(xì)胞24h則使巨噬細(xì)胞獲得最顯著的M2表型,巨噬細(xì)胞的極化是一個(gè)連續(xù)的過程,M1、M2只是極化過程的兩個(gè)極端。
　　2、功能極化的巨噬細(xì)胞(M1、M2)在體外微環(huán)境發(fā)生改變時(shí)均可發(fā)生重分化,具有較強(qiáng)的可塑性。
　　3、Trichos