LIM蛋白FHL1C-KyoT2抑制Notch信號(hào)及調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的分子機(jī)制研究.pdf

1、轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)（Translational Medicine)是21世紀(jì)國(guó)際醫(yī)學(xué)科學(xué)領(lǐng)域的親新概念，是一種打破單一地追求基礎(chǔ)研究成果或臨床療效的僵局，致力于使基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用通力合作，以患者為中心，提高整體醫(yī)療水平的新概念。隨著我國(guó)老齡化社會(huì)的到來(lái)，轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)理念在老年醫(yī)學(xué)的教育和臨床工作中必將發(fā)揮更大的作用。
　　細(xì)胞是生命體結(jié)構(gòu)形成和功能實(shí)現(xiàn)的承擔(dān)者。當(dāng)細(xì)胞外的信號(hào)通過(guò)細(xì)胞膜傳遞至細(xì)胞內(nèi)時(shí)，細(xì)胞會(huì)依據(jù)所接收的信號(hào)激發(fā)一系列生物化學(xué)反

2、應(yīng)，完成某種信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。Notch信號(hào)通路表達(dá)廣泛，屬于在進(jìn)化上高度保守的單次跨膜受體蛋白，主要通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞之間的信息傳遞而參與調(diào)控細(xì)胞生物發(fā)育，繼而引起一系列生物學(xué)行為。Notch信號(hào)活化最早由臨近細(xì)胞表面的Notch配體和受體接觸開(kāi)始，當(dāng)Notch蛋白經(jīng)歷三次剪切后，胞內(nèi)片段N IC D被釋放入核，并與信號(hào)通路最關(guān)鍵分子一轉(zhuǎn)錄因子RBP-J結(jié)合而募集轉(zhuǎn)錄共激活復(fù)合物，啟動(dòng)下游基因的表達(dá)。大量研究證明， Notch信號(hào)在細(xì)胞、組織

3、、器官的分化、發(fā)育過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用。人類多種疾病，如遺傳病、腫瘤、老年病等的產(chǎn)生都與N otch通路組成分子的突變和表達(dá)異常密切相關(guān)，而轉(zhuǎn)錄因子RBP-J是介導(dǎo)Notch信號(hào)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。因而我們?cè)O(shè)想，靶向RBP-J介導(dǎo)的Notch通路的轉(zhuǎn)錄調(diào)控一定會(huì)在疾病的治療和轉(zhuǎn)歸過(guò)程中產(chǎn)生積極的指導(dǎo)作用。
　　國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)：N otch信號(hào)通路的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄分子RBP-J可與 LIM結(jié)構(gòu)域蛋白KyoT2(人FHL1C在小鼠中的同源物）

4、結(jié)合而募集多種轉(zhuǎn)錄共抑制分子，從而抑制RBP-J介導(dǎo)的Notch信號(hào)下游基因的轉(zhuǎn)錄，抑制Notch信號(hào)的活化。課題組前期的研究揭示:FHLlC/KyoT2發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制是通過(guò)與RING1和HPC2相互作用，并與RBP-J形成復(fù)合物而實(shí)現(xiàn)的。然而，F(xiàn)HLlC/KyoT2分子缺少核定位相關(guān)信號(hào)，其入核調(diào)控各類分子的機(jī)制很有可能是通過(guò)其它間接方式完成，如：改變修飾方式，或者通過(guò)與其他核蛋白的相互作用實(shí)現(xiàn)。課題組前期為揭示FHL1C入核介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄抑

5、制的機(jī)制，利用蛋白質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)：FHL1C可能與鳥(niǎo)嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白P亞基中的GNB2蛋白相互作用。進(jìn)一步證實(shí)FHL1C與GNB2之間存在相互作用以及揭示其作用機(jī)制將有助于深入了解FHL1C對(duì)Notch信號(hào)抑制的分子機(jī)制。
　　巨噬細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)重要的吞噬和抗原提呈細(xì)胞，巨噬細(xì)胞不同的極化分型與老年病、代謝性疾病、腫瘤等多系統(tǒng)、多臟器疾病存在相關(guān)性，而極化狀態(tài)的失衡是引起一系列疾病發(fā)生的關(guān)鍵。因此，合理干預(yù)巨噬細(xì)胞極化的相關(guān)步驟，扭

6、轉(zhuǎn)表型失衡狀態(tài)，避免免疫相關(guān)性疾病的發(fā)生和指導(dǎo)治療具有實(shí)際的臨床應(yīng)用價(jià)值。文獻(xiàn)和課題組前期在實(shí)體瘤中研究證明，N otch信號(hào)與巨噬細(xì)胞極化存在及其緊密的關(guān)系：Notch信號(hào)激活可促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M l型極化，發(fā)揮促炎、抗腫瘤的作用；剔除Notch信號(hào)關(guān)鍵分子RBP-J，促使巨噬細(xì)胞向M2型極化，發(fā)揮抗炎、促腫瘤的作用。但N otch信號(hào)調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的詳細(xì)分子機(jī)制尚不清楚。因而，為了進(jìn)一步揭示Notch信號(hào)調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的分子機(jī)制，

7、我們?cè)谛∈蠊撬鑱?lái)源原代巨噬細(xì)胞中觀察了Notch信號(hào)轉(zhuǎn)錄抑制物KyoT2通過(guò)調(diào)控Notch活性而對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響，為靶向Notch信號(hào)調(diào)控巨噬細(xì)胞極化治療相關(guān)疾病奠定理論基礎(chǔ)。
　　為了更全面的闡明Notch信號(hào)抑制物FHLlC/KyoT2的生物功能，我們利用免疫共沉淀和哺乳動(dòng)物雙雜交技術(shù)，從分子、細(xì)胞水平驗(yàn)證FHL1C與其候選相互作用分子GNB2的關(guān)系，進(jìn)而豐富FHL1C調(diào)控Notch信號(hào)通路的分子機(jī)制。為了觀察LIM結(jié)構(gòu)域

8、蛋白KyoT2能否通過(guò)Notch調(diào)控巨噬細(xì)胞極化，我們利用分子生物學(xué)方法和技術(shù)，觀察沉默KyoT2后Notch信號(hào)通路及巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)的改變，以期進(jìn)一步完善Notch信號(hào)調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的作用和機(jī)制，為將來(lái)靶向干預(yù)Notch信號(hào)通路及巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答提供新思路和新策略。本課題分兩部分完成，具體如下：
　　1、LIM結(jié)構(gòu)域蛋白FHL1C與GNB2相互作用驗(yàn)證
　　1)通過(guò)分子克隆技術(shù)成功構(gòu)建GNB2的真核表達(dá)載體pCMV-V

9、P16-GNB2和pCMV-Flag-GNB2,轉(zhuǎn)化擴(kuò)增新構(gòu)建載體及實(shí)驗(yàn)室保存的FHL1C的真核表達(dá)載體pCMV-GAL4-DBD-FHLlC和 pCMV-myc-FHLIC。酶切結(jié)果符合相對(duì)應(yīng)條帶大小，DNA測(cè)序正確。
　　2)利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染及雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)方法進(jìn)行哺乳動(dòng)物雙雜交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果提示相對(duì)于陽(yáng)性對(duì)照組，F(xiàn)HL1C和GNB2實(shí)驗(yàn)組不能激活下游報(bào)告基因Luciferase的表達(dá)，F(xiàn)HL1C和GNB2間不具有物理相互作用

10、。
　　3)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞裂解液中FHL1C與GNB2是否形成共沉淀復(fù)合物。Western blot結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組中GNB2與FHL1C未形成共沉淀復(fù)合物，提示FHL1C和 GNB2不存在生理上相互作用。
　　2、LIM結(jié)構(gòu)域蛋白KyoT2通過(guò)Notch信號(hào)調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的初步研究
　　1)誘導(dǎo)分化骨髓單核細(xì)胞6天，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)鑒定CDllb/F4/80雙陽(yáng)性巨噬細(xì)胞數(shù)量，確定骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)分化成巨噬細(xì)

11、胞的效率。采用LPS+IFN-Y誘導(dǎo)Ml型巨噬細(xì)胞、IL-4誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)巨噬細(xì)胞極化標(biāo)志物的表達(dá)(P＜0.01)，確定巨噬細(xì)胞極化誘導(dǎo)成功。
　　2)通過(guò)PCR技術(shù)檢測(cè)不同極化狀態(tài)下小鼠巨噬細(xì)胞中KyoT2的表達(dá)。采用siRNA技術(shù)沉默巨噬細(xì)胞中KyoT2基因的同時(shí)，巨噬細(xì)胞中Notch信號(hào)下游基因Hesl、Heyl表達(dá)被激活(P＜0.05)，Notch信號(hào)活化。
　　3)沉默巨噬細(xì)胞不同表型中

12、KyoT2表達(dá)后，與對(duì)照組相比，巨噬細(xì)胞M l型標(biāo)志性分子表達(dá)無(wú)顯著改變，M2型標(biāo)志性分子表達(dá)降低(P＜0.05)。提示：KyoT2促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型極化。
　　綜上所述，本課題豐富了LIM蛋白FHLlC/KyoT2抑制Notch信號(hào)及調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的分子機(jī)制。主要研究結(jié)論為：
　　1、LIM結(jié)構(gòu)域蛋白FHL1C與GNB2之間未發(fā)現(xiàn)明顯的物理和生理上相互作用。質(zhì)譜分析的FHL1C與其他候選分子的相互作用的研究仍需要繼續(xù)進(jìn)