HCV core蛋白誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞負(fù)調(diào)控分子A20高表達(dá)及機(jī)制研究.pdf

1、目的:主要研究HCV core蛋白作用的巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子的分泌及負(fù)調(diào)控分子A20的表達(dá)情況，并揭示相關(guān)機(jī)制，旨在探討HCV core蛋白作用下巨噬細(xì)胞的功能變化，這將有助于了解巨噬細(xì)胞在HCV慢性感染中的功能角色，為揭示HCV的致病機(jī)理及研究治療方案提供新的視角。
　　方法:1.通過原核表達(dá)蛋白系統(tǒng)，表達(dá)并純化HCV core蛋白，行SDS-PAGE和Western blot鑒定。HCV core蛋白經(jīng)內(nèi)毒素去除試劑盒處理后，用顯

2、色基質(zhì)鱟試劑盒檢測(cè)內(nèi)毒素的含量，并用Bradford法定量HCV core蛋白。
　　2.人單核細(xì)胞THP-1經(jīng)PMA誘導(dǎo)48 h即分化為巨噬細(xì)胞狀態(tài)MΦ-THP-1。不同濃度HCV core蛋白（1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml）作用巨噬細(xì)胞（MΦ-THP-1）3h和6h，Western blot檢測(cè)負(fù)調(diào)控分子A20的表達(dá)變化，確定HCV core蛋白的使用濃度。用特定濃度HCV core蛋白作用巨噬細(xì)胞MΦ-THP-

3、1及小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞BMDM，不同時(shí)間段檢測(cè)A20表達(dá)變化情況。
　　3.構(gòu)建針對(duì)A20的shRNA干擾質(zhì)粒，經(jīng)慢病毒包裝，感染THP-1單核細(xì)胞，建立干擾A20的穩(wěn)定細(xì)胞系THP-1-sh-A20，同時(shí)建立干擾luciferase的對(duì)照細(xì)胞系THP-1-sh-luciferase。兩細(xì)胞經(jīng)PMA誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞狀態(tài)(MΦ-THP-1-sh-A20和MΦ-THP-1-sh-luciferase)。HCV core蛋白分別作

4、用兩個(gè)巨噬細(xì)胞，3h、6h取樣，Western blot檢測(cè)A20的表達(dá)變化，驗(yàn)證A20的干擾效果。
　　4.HCV core蛋白作用巨噬細(xì)胞（MΦ-THP-1），于4h、8h、12h、24hCBA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子TNF、IL-6、IL-1β和TGF-β1的表達(dá)情況，同時(shí)亦將core蛋白分別作用的干擾了A20的細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞，檢測(cè)培養(yǎng)上清中與上相同細(xì)胞因子的表達(dá)，以確定細(xì)胞因子的分泌與負(fù)調(diào)控分子A20表達(dá)的關(guān)系。

5、　　5.Pull-down實(shí)驗(yàn):將結(jié)合在Ni Agarose上的HCV core蛋白與MΦ-THP-1細(xì)胞裂解液作用，體外進(jìn)行Pull-down實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用gC1qR、TLR2及TLR4抗體研究HCV core蛋白與巨噬細(xì)胞膜受體gC1qR、TLR2及TLR4的結(jié)合情況。
　　6.以gC1qR的配體C1q純品（終濃度70μg/ml）作用巨噬細(xì)胞（MΦ-THP-1）6h，Western blot檢測(cè)并證明巨噬細(xì)胞負(fù)調(diào)控分子A20的表達(dá)

6、。
　　7.構(gòu)建針對(duì)gC1qR的shRNA干擾質(zhì)粒，經(jīng)慢病毒包裝，感染THP-1單核細(xì)胞，建立干擾gC1qR的穩(wěn)定細(xì)胞系THP-1-sh-gC1qR，經(jīng)PMA誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞狀態(tài)(MΦ-THP-1-sh-gC1qR)。Western blot驗(yàn)證gC1qR的干擾效果，同時(shí)以MΦ-THP-1-sh-luciferase、MΦ-THP-1為對(duì)照。
　　8.HCV core蛋白分別作用干擾gC1qR的細(xì)胞及對(duì)照細(xì)胞，不同時(shí)間取樣

7、，Western blot檢測(cè)A20的表達(dá)變化情況，明確負(fù)調(diào)控分子A20產(chǎn)生與受體gC1qR的關(guān)系。
　　9.HCV core蛋白作用巨噬細(xì)胞（MΦ-THP-1）及小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞(BMDM)，不同時(shí)間取樣，Western blot檢測(cè)信號(hào)分子p-p38、p-JNK、p-ERK、p-NF-κB p65、p-NF-κB p105、p-AKT的表達(dá)變化。
　　10.HCV core蛋白分別作用干擾gC1qR的細(xì)胞（MΦ-T

8、HP-1-sh-gC1qR）和對(duì)照細(xì)胞（MΦ-THP-1-sh-luciferase）不同時(shí)間，Western blot檢測(cè)p-p38、p-JNK、p-ERK、p-NF-κB p65、p-NF-κB p105、p-AKT蛋白的表達(dá)變化，明確與gC1qR活化有關(guān)的信號(hào)通路。
　　11.gC1qR的配體C1q作用巨噬細(xì)胞MΦ-THP-130 min，Western blot檢測(cè)信號(hào)分子p-p38、p-JNK、p-ERK、p-NF-κB

9、 p65、p-NF-κBp105、p-AKT的表達(dá)變化，驗(yàn)證gC1 qR活化相關(guān)的信號(hào)通路。
　　12.不同濃度的化學(xué)抑制劑SB203580（p38抑制劑）、SP600125（JNK抑制劑）、PD98059（ERK抑制劑）、IMD0354（IKKβ抑制劑）、Wortmannin（PI3K抑制劑）、MK22062HCl（AKT抑制劑）分別預(yù)處理巨噬細(xì)胞(MΦ-THP-1)30 min，再用HCV core蛋白繼續(xù)作用30 min，W

10、estern blot分別檢測(cè)p-p38、p-JNK、p-ERK、p-NF-κB p65、p-AKT蛋白的表達(dá)變化。以最佳作用濃度的抑制劑分別預(yù)處理巨噬細(xì)胞30 min，再用HCV core蛋白繼續(xù)作用3h、6h，Western blot檢測(cè)負(fù)調(diào)控分子A20的表達(dá)變化，明確信號(hào)通路與誘導(dǎo)A20高表達(dá)的關(guān)系。
　　結(jié)果:1.成功表達(dá)、純化了HCV core蛋白，SDS-PAGE和Western blot證實(shí)為單一目的條帶。
　

11、　2.HCV core蛋白可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞負(fù)調(diào)控分子A20高表達(dá)
　　3.成功建立干擾A20的穩(wěn)定細(xì)胞系THP-1-sh-A20
　　將A20的shRNA干擾質(zhì)粒感染THP-1單核細(xì)胞，建立干擾A20的穩(wěn)定細(xì)胞系THP-1-sh-A20，同時(shí)建立干擾luciferase的穩(wěn)定細(xì)胞系THP-1-sh-luciferase為對(duì)照。繼而以HCV core蛋白作用兩種細(xì)胞，分別于3h和6h檢測(cè)，干擾組A20表達(dá)明顯低于對(duì)照組（P＜0.

12、05），干擾效果明顯。
　　4.HCV core蛋白可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，其中IL-6、IL-1β和TGF-β1表達(dá)受A20負(fù)向調(diào)節(jié)
　　5.HCV core蛋白與gC1qR結(jié)合誘導(dǎo)A20表達(dá)
　　6.HCV core蛋白與gC1qR結(jié)合可活化巨噬細(xì)胞MAPK、NF-κB及PI3K/AKT信號(hào)通路
　　HCV core蛋白作用巨噬細(xì)胞(MΦ-THP-1)及小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞(BMDM)15 min、30

13、min、1h，Western blot檢測(cè)，信號(hào)分子p-p38、p-JNK、p-ERK、p-NF-κB p65、p-NF-κBp105、p-AKT的表達(dá)均明顯升高(P＜0.05)。
　　將HCV core蛋白作用干擾 gC1qR的巨噬細(xì)胞（MΦ-THP-1-sh-gC1qR），不同時(shí)間段，與三條通路相關(guān)的信號(hào)分子p-p38、p-JNK、p-NF-κB p65、p-NF-κB p105、p-AKT的表達(dá)均明顯低于對(duì)照細(xì)胞（MΦ-TH

14、P-1-sh-luciferase）(P＜0.05)。
　　而以C1q作用巨噬細(xì)胞(MΦ-THP-1)30 min，顯示p-p38、p-JNK、p-ERK、p-AKT蛋白表達(dá)明顯升高(P＜0.05)，而p-NF-κB p65、p-NF-κBp105蛋白表達(dá)無變化。
　　以上結(jié)果提示:雖然C1q、HCV core蛋白都是受體gC1qR的配體，但結(jié)合方式、涉及的信號(hào)通路依然存在差異。
　　7.p38、JNK和NF-κB信號(hào)

15、通路的活化在HCV core蛋白誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞A20高表達(dá)中起主要作用
　　首先，經(jīng)過系列相關(guān)實(shí)驗(yàn)，確定了以下各抑制劑的使用濃度:
　　p38抑制劑SB203580的應(yīng)用濃度為30μM; JNK抑制劑SP600125的應(yīng)用濃度為20μM;ERK抑制劑PD98059為50μM; IKKβ抑制劑IMD0354為3μM;PI3K抑制劑Wortmannin為200 nM; AKT抑制劑MK22062HCl為5μM。
　　結(jié)果顯示

16、:化學(xué)抑制劑SB203580、SP600125、IMD0354可以抑制HCV core蛋白誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞A20高表達(dá)(P＜0.05)，而PD98059、Wortmannin、MK22062HCl對(duì)HCV core蛋白誘導(dǎo)的A20高表達(dá)無抑制作用。提示p38、JNK和NF-κB信號(hào)通路的活化對(duì)誘導(dǎo)A20高表達(dá)起主要作用。
　　結(jié)論:1.HCV core蛋白可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞負(fù)調(diào)控分子A20高表達(dá)，A20的表達(dá)可負(fù)向調(diào)節(jié)HCV core蛋