YdiV負(fù)調(diào)控細(xì)胞鞭毛合成的分子機(jī)制研究.pdf

1、鞭毛是很多細(xì)菌具有的運(yùn)動(dòng)器官。自然界中的細(xì)菌，利用鞭毛的推動(dòng)，運(yùn)動(dòng)到營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)更豐富、更有力于其生存的環(huán)境中。有些致病菌的鞭毛還與其致病性密切相關(guān)。例如，在致病菌侵染人體初期，鞭毛功能正常的細(xì)菌能較快吸附到人體細(xì)胞上，依靠鞭毛的推動(dòng)突破人體表皮粘膜的防護(hù)。而失去鞭毛的菌株將失去吸附能力，從而喪失其致病性。因此，細(xì)菌鞭毛的合成途徑是設(shè)計(jì)新型抗菌藥物的重要的靶點(diǎn)之一。
　　 細(xì)菌的鞭毛實(shí)際上是一個(gè)大的蛋白質(zhì)復(fù)合體，鞭毛蛋白的合成和組裝

2、由一系列的蛋白共同參與來(lái)完成。鞭毛基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯都有著嚴(yán)格的時(shí)序性。大腸桿菌基因組中有超過(guò)25個(gè)操縱子、近60個(gè)基因直接參與鞭毛的合成過(guò)程。根據(jù)基因的轉(zhuǎn)錄順序的不同，這些基因被分為三類:第一級(jí)鞭毛基因，第二級(jí)鞭毛基因和第三級(jí)鞭毛基因。處于整個(gè)流程最上游的、最先被轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的是flhDC操縱子。此操縱子中包含flhD和flhC兩個(gè)基因。這兩個(gè)基因的表達(dá)產(chǎn)物組裝成異源蛋白質(zhì)六聚體FlhD4C2。FlhD4C2復(fù)合物能夠結(jié)合在第二級(jí)鞭毛基因

3、上游的啟動(dòng)子位置，是啟動(dòng)這些基因的轉(zhuǎn)錄所必需的。第二級(jí)鞭毛基因包含編碼組成基體和鉤型鞘的蛋白質(zhì)、鞭毛特異的三型分泌系統(tǒng)的組分蛋白及鞭毛特異的轉(zhuǎn)錄因子δ28的基因。第三級(jí)鞭毛基因的表達(dá)產(chǎn)物包括鞭毛組裝蛋白、調(diào)控鞭毛功能的蛋白以及一些未知功能的蛋白。鞭毛基因這種分層調(diào)控的特征在革蘭氏陰性細(xì)菌中是高度保守的。
　　 鞭毛蛋白的表達(dá)和鞭毛的合成過(guò)程是高度有序的過(guò)程，鞭毛的調(diào)控也會(huì)受到很多因子的在不同層次的調(diào)控。對(duì)于flhDC操縱子的調(diào)控

4、是最關(guān)鍵的調(diào)控點(diǎn)，多種調(diào)控因子分別在DNA，mRNA以及蛋白水平上對(duì)于此操縱子進(jìn)行調(diào)控。本文的研究對(duì)象YdiV是最近被識(shí)別的、在蛋白水平上調(diào)控FlhDC功能的蛋白。
　　 YdiV屬于負(fù)責(zé)降解C-di-GMP的EAL蛋白家族中的一員。但YdiV序列中負(fù)責(zé)催化C-di-GMP降解所必需的10個(gè)保守的氨基酸中8個(gè)發(fā)生了突變。也就是說(shuō)YdiV可能不具有降解C-di-GMP的功能。早期的研究發(fā)現(xiàn)這個(gè)蛋白功能與EAL的同源蛋白有很大不同:

5、正常EAL結(jié)構(gòu)域的蛋白正調(diào)控細(xì)菌的移動(dòng)性，而YdiV蛋白顯著抑制細(xì)菌的鞭毛合成和移動(dòng)性;YdiV蛋白對(duì)細(xì)胞內(nèi)C-di-GMP濃度的影響也存在著爭(zhēng)議。2011年，Wada等將沙門(mén)式菌中YdiV蛋白的作用對(duì)象鎖定在FlhDC復(fù)合物上，但這一過(guò)程中的具體機(jī)制仍然不明確。另外，2012年Takaya等人研究發(fā)現(xiàn)YdiV協(xié)助ClpXP蛋白酶降解FlhDC復(fù)合物，而本身不被降解。這一過(guò)程的機(jī)制也未知。本論文研究試圖通過(guò)結(jié)構(gòu)生物學(xué)、生物化學(xué)、分子生物

6、學(xué)及微生物學(xué)的多種實(shí)驗(yàn)方法結(jié)合來(lái)揭示YdiV抑制細(xì)菌移動(dòng)性這一過(guò)程的分子機(jī)制。
　　 本論文的主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)論如下:
　　 (1)使用蛋白質(zhì)晶體X射線衍射法解析得到了1.9(A)分辨率的大腸桿菌YdiV蛋白結(jié)構(gòu)。將YdiV結(jié)構(gòu)與其他EAL結(jié)構(gòu)進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)兩者在折疊類型上較相似，但是結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)有較大的差別。與其他EAL蛋白不同，YdiV在溶液中以單體形式存在。雖然YdiV不能結(jié)合C-di-GMP，但保守的C-di-GMP結(jié)

7、合凹槽仍然存在。YdiV的結(jié)構(gòu)中，此凹槽中結(jié)合了一個(gè)甘油分子和一個(gè)磷酸分子。這說(shuō)明YdiV雖不能結(jié)合C-di-GMP，但其可能結(jié)合某些比C-di-GMP小的、構(gòu)象類似的小分子，由此來(lái)調(diào)控其下游的功能。
　　 (2)首次驗(yàn)證了大腸桿菌YdiV蛋白的FlhDC的相互作用。并將YdiV相互作用的對(duì)象鎖定在FlhD上。為了找到與YdiV相互作用的最小FlhD片段，克隆了四個(gè)FlhD片段-FlhD1-71aa，F(xiàn)lhD1-82aa，F(xiàn)lh

8、D1-98aa，F(xiàn)lhD1-106aa。將于YdiV相互作用的區(qū)域確定為FlhD的N端71個(gè)氨基酸。EMSA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Ydiv抑制FlhDC結(jié)合DNA呈現(xiàn)濃度效應(yīng):當(dāng)YdiV的濃度比較低時(shí)，YdiV與FlhDC形成的復(fù)合物還能結(jié)合DNA，但當(dāng)YdiV與FlhDC的比例超過(guò)3以后，形成的復(fù)合物就不能結(jié)合DNA。
　　 (3)使用蛋白質(zhì)晶體X射線衍射法解析得到了2.9(A)分辨率的YdiV-FlhD復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)分析結(jié)合生化實(shí)驗(yàn)證

9、明，在溶液狀態(tài)下復(fù)合物以YdiV2-FlhD2四聚體的形式存在。YdiV的第6、7、8個(gè)α螺旋與FlhD的第1、4個(gè)α螺旋組成兩蛋白的相互作用面。復(fù)合物結(jié)構(gòu)中YdiV、FlhD與各自的單體結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化都不大，但參與相互作用的具體氨基酸有比較大的構(gòu)象變化。通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，參與YdiV與FlhD相互作用的氨基酸在所有腸道細(xì)菌中都非常保守，暗示其他腸道細(xì)菌中YdiV同源蛋白通過(guò)相同的機(jī)制發(fā)揮功能。
　　 (4)通過(guò)對(duì)FlhD4C2

10、復(fù)合物的結(jié)構(gòu)分析，找到了位于蛋白質(zhì)表面可能與DNA結(jié)合有關(guān)的正電荷密集的區(qū)域。并通過(guò)定點(diǎn)突變的方法，克隆并純化得了多種FlhD4C2的突變體。EMSA實(shí)驗(yàn)證明突變體蛋白都完全喪失了DNA結(jié)合的活性。這一數(shù)據(jù)有力的證明，F(xiàn)lhC上正電荷富集的區(qū)域和環(huán)狀結(jié)構(gòu)都是FlhD4C2結(jié)合DNA所必須的。DNA主要結(jié)合在FlhC亞基上，而FlhD亞基對(duì)于形成和穩(wěn)定FlhD4C2環(huán)狀結(jié)構(gòu)和DNA結(jié)合都是必不可少的。最后，提出了FlhD4C2復(fù)合物與DN

11、A相互作用的模型:DNA與FlhC上正電荷富集的區(qū)域互作，并被FlhC上的鋅指結(jié)構(gòu)固定。整體構(gòu)象上，DNA呈現(xiàn)一定的彎曲度，并且DNA是環(huán)繞FlhC亞基的。
　　 (5)通過(guò)YdiV-FlhD結(jié)構(gòu)與FlhD4C2結(jié)構(gòu)的疊合，模擬出了YdiV1-FlhD4C2，YdiV2-FlhD4C2.YdiV3-FlhD4C2和YdiV4-FlhD4C2四種三元復(fù)合物的結(jié)構(gòu)模型。使用負(fù)染電鏡的方法觀察到了不同構(gòu)象的YdiV-FlhDC三元復(fù)合

12、物，驗(yàn)證了我們提出的三元復(fù)合物結(jié)構(gòu)模型。
　　 (6)構(gòu)建了多種YdiV突變體來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證突變體功能。發(fā)現(xiàn)不能與FlhD互作的YdiV突變體也都不能抑制FlhD4C2的DNA結(jié)合活性，并且不影響細(xì)菌的移動(dòng)性。說(shuō)明YdiV蛋白影響細(xì)菌移動(dòng)性的原因確實(shí)是由其與FlhD相互作用而引發(fā)的。另外，我們分析YdiV-FihD結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)了沙門(mén)式菌同源蛋白CdgR的一些突變體。使用Pulldown方法檢測(cè)了這些突變體與stFlhD和stFlhD

13、C的相互作用。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)暗示沙門(mén)氏菌CdgR蛋白與YdiV蛋白的作用機(jī)制是類似的。
　　 (7)對(duì)YdiV蛋白與ClpX蛋白相互作用情況進(jìn)行了初步的研究。YdiV與ClpX的ZBD結(jié)構(gòu)域在體內(nèi)共轉(zhuǎn)共純化時(shí)存在相互作用，而當(dāng)分別提純得到兩種蛋白在體外卻檢測(cè)不到蛋白間的相互作用。提出細(xì)胞內(nèi)某小分子（與C-di-GMP有類似的結(jié)構(gòu)）可能結(jié)合到Y(jié)diV的疏水口袋調(diào)控YdiV與CipX的相互作用的假說(shuō)。
　　 根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提出

14、了YdiV負(fù)調(diào)控細(xì)菌鞭毛合成和移動(dòng)性的分子機(jī)制模型:溶液中的YdiV蛋白以單體形式存在。YdiV蛋白主要通過(guò)第8個(gè)α螺旋與FlhD分子上第1和第4個(gè)α螺旋相互作用。在FlhD4C2復(fù)合物中，四個(gè)FlhD分子(D1，D2，D3，D4)所處的狀態(tài)不同。D1-D2和D3-D4各自組成二聚體。而D2和D3分子的相互作用面也是由其第1和第4個(gè)α螺旋介導(dǎo)的。由于D1和D4分子的第1和第4個(gè)α螺旋是暴露的，所以當(dāng)YdiV分子處于較低的濃度時(shí)，YdiV

15、分子優(yōu)先結(jié)合在這兩個(gè)FlhD分子上。DNA結(jié)合在FlhD4C2復(fù)合物的FlhC亞基外側(cè)上，幾乎不與FlhD接觸。所以YdiV結(jié)合在D1和D4上時(shí)候，形成的YdiV1FlhD4C2和YdiV2FlhD4C2三元復(fù)合物還能和DNA結(jié)合，這時(shí)FlhDC的轉(zhuǎn)錄因子活性并沒(méi)有受到抑制。當(dāng)YdiV濃度升高到一定程度，當(dāng)所有的D1和D4亞基都被飽和的時(shí)候，YdiV就開(kāi)始吸附D2或D3分子。這時(shí)由于YdiV的侵入，F(xiàn)lhD4C2六元環(huán)狀結(jié)構(gòu)被迫打開(kāi)。目

16、的DNA與FlhD4C2結(jié)合是一個(gè)精確的定位過(guò)程，DNA結(jié)合到FlhD4C2分子上時(shí)呈現(xiàn)一定的弧度，F(xiàn)lhD4C2的圓環(huán)狀構(gòu)象對(duì)于其結(jié)合DNA的能力也是必不可少的。多個(gè)YdiV結(jié)合導(dǎo)致FlhD4C2六元環(huán)狀結(jié)構(gòu)被破壞，DNA將不能結(jié)合到此復(fù)合物上。這時(shí)FlhD4C2轉(zhuǎn)錄輔助因子的功能喪失，第二級(jí)及之后的鞭毛蛋白停止表達(dá)。最終導(dǎo)致鞭毛合成受阻，細(xì)菌的移動(dòng)性減弱甚至消失。FlhD4C2復(fù)合物結(jié)合過(guò)量YdiV后環(huán)狀結(jié)構(gòu)打開(kāi)，結(jié)構(gòu)變的疏松。Yd

17、iV蛋白通過(guò)與細(xì)胞內(nèi)ClpXP蛋白酶的ClpX亞基的ZBD結(jié)構(gòu)域互作，促進(jìn)其結(jié)合的FlhD4C2復(fù)合物被ClpXP蛋白酶降解掉。YdiV調(diào)控鞭毛表達(dá)和細(xì)菌移動(dòng)性的過(guò)程是濃度依賴的并且是不可逆的。
　　 細(xì)胞內(nèi)YdiV的濃度受到很多因素的影響。已有文獻(xiàn)報(bào)道，外界葡萄糖的濃度顯著影響細(xì)胞內(nèi)YdiV蛋白的濃度。另外，ydiV基因轉(zhuǎn)錄活性受轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子SdiA蛋白的調(diào)節(jié)，而SdiA蛋白與DNA的結(jié)合活力又受細(xì)菌產(chǎn)生的自誘導(dǎo)物的直接影響。

18、即細(xì)菌所處環(huán)境的菌濃的不同，細(xì)胞內(nèi)的YdiV的濃度也會(huì)不同。我們的研究發(fā)現(xiàn)只有在YdiV濃度足夠高時(shí)，細(xì)菌的鞭毛合成才會(huì)完全停止。細(xì)菌的鞭毛表達(dá)是個(gè)十分耗時(shí)和耗能的過(guò)程，細(xì)菌鞭毛合成與否是細(xì)菌生命狀態(tài)的一個(gè)重大決定。只有當(dāng)外界信號(hào)分子的濃度足夠大并且持續(xù)時(shí)間足夠長(zhǎng)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的YdiV的表達(dá)量才會(huì)積累到足夠的濃度，這時(shí)細(xì)菌的鞭毛合成才被迫從源頭終止。YdiV蛋白作為EAL蛋白家族的一員，其發(fā)揮的功能與正常EAL蛋白南轅北轍。這一現(xiàn)象給我們