誘導(dǎo)子調(diào)控紅松細(xì)胞合成松多酚機(jī)制的研究.pdf

1、多酚是紅松中具有重要生理功能的次生代謝產(chǎn)物，可以提高機(jī)體抗氧化能力，有助于預(yù)防癌癥和心腦血管疾病的發(fā)生，在營養(yǎng)、健康、醫(yī)藥領(lǐng)域的關(guān)注度逐漸提高。因此研究紅松多酚合成代謝途徑及其調(diào)控手段具有重要的意義。本研究以組織培養(yǎng)紅松胚誘導(dǎo)生成的不定芽為實(shí)驗(yàn)材料，以8種誘導(dǎo)子(PHE、CA、MeJA、SA、CTS、YE、La、Eu)為研究對象，以多酚和原花青素含量為指標(biāo)，進(jìn)行誘導(dǎo)子的篩選工作，確立促進(jìn)紅松多酚合成最佳的誘導(dǎo)子以及最佳的誘導(dǎo)處理組合條件

2、，進(jìn)一步分析誘導(dǎo)子對紅松氧化應(yīng)激防御系統(tǒng)的影響;采用Illumina HiSeq技術(shù)對紅松進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，挖掘與多酚生物合成相關(guān)功能基因，分析紅松多酚的合成代謝途徑;采用RT-PCR技術(shù)分析誘導(dǎo)子對紅松多酚合成相關(guān)功能基因的表達(dá)影響，探究誘導(dǎo)子調(diào)控多酚合成的作用機(jī)制。主要的研究結(jié)果如下：
　　在供試濃度范圍內(nèi)，不同的誘導(dǎo)子對紅松不定芽的生長具有不同的生理作用，PHE、CTS、YE、La和Eu在合適的濃度范圍內(nèi)可以顯著促進(jìn)生長;CA

3、、MeJA和SA明顯抑制生長;高濃度的PHE、CTS也會(huì)抑制生長。7種誘導(dǎo)子(PHE、MeJA、SA、CTS、YE、La、Eu)在合適的濃度范圍內(nèi)可以顯著提高多酚和原花青素的積累量，促進(jìn)多酚物質(zhì)的合成，最佳的誘導(dǎo)濃度分別為2mmol/L PHE、10μmol/L MeJA、40μmol/LSA、100 mg/L CTS、100mg/L YE、100μmol/L La和400μmol/L Eu。
　　Plackett-Burman實(shí)

4、驗(yàn)結(jié)果顯示，7種誘導(dǎo)子因素影響多酚積累量的顯著性大小依次為:CTS＞La＞MeJA＞PHE＞Eu＞SA＞YE，確定影響多酚積累量的3種關(guān)鍵因素為:CTS、La、MeJA。通過對CTS+La+MeJA組合誘導(dǎo)條件進(jìn)行Box-Benhnken Design響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化得到的最佳誘導(dǎo)條件為:CTS79.58mg/L、La42.21μmol/L、MeJA16.63μmol/L，預(yù)測多酚積累量最高可達(dá)到14.28mg/g FW，實(shí)際多酚積

5、累量為13.42 mg/gFW，與對照組相比提高了122.19％。3種誘導(dǎo)子CTS、La、MeJA促進(jìn)多酚合成具有協(xié)同增效作用。
　　3種誘導(dǎo)子MeJA、CTS、La以及CTS+ La+MeJA組合可以顯著激活紅松抗氧化防御反應(yīng)和苯丙烷代謝途徑，促進(jìn)多酚物質(zhì)合成與積累，誘導(dǎo)響應(yīng)時(shí)間和強(qiáng)度具有差異性。CTS+ La+MeJA組合誘導(dǎo)效果顯著優(yōu)于3種誘導(dǎo)子單獨(dú)使用，利用3種誘導(dǎo)子之間的協(xié)同作用，可以緩解MeJA對紅松不定芽生長的抑制作

6、用;更大程度提高紅松氧化應(yīng)激防御系統(tǒng)抗氧化酶(SOD、POD、CAT、PAL、C4H)的活性和增加抗氧化物質(zhì)（多酚、原花青素）的積累量。CTS+ La+MeJA作為外源誘導(dǎo)子通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)將誘導(dǎo)信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)，迅速刺激紅松不定芽的氧化應(yīng)激防御系統(tǒng)，苯丙烷代謝途徑被活化，促進(jìn)了抗氧化物質(zhì)多酚的合成與積累。
　　通過Illumina HiSeq技術(shù)對紅松不定芽進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序分析，獲得了13369359條contig，172608

7、條unigene。將獲得的unigene與NR、GO、KOG和KEGG基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對和功能預(yù)測。其中58406(33.84％)條unigenes得到了功能注釋;17996條μnigene歸納到GO數(shù)據(jù)庫的48個(gè)聚類中;26026條unigene被注釋到KOG數(shù)據(jù)庫的25個(gè)功能類別;9846條unigene歸入KEGG數(shù)據(jù)庫的334條生物學(xué)通路中;997條unigene參與了次生代謝生物合成。通過功能注釋發(fā)現(xiàn)有49條unigene參與

8、了紅松多酚的生物合成，涉及了5條次生代謝生物合成途徑（苯丙烷生物合成途徑、類黃酮生物合成途徑、黃酮和黃酮醇生物合成途徑、花青素生物合成途徑、二苯乙烯生物合成途徑）和14個(gè)相關(guān)功能基因(PAL、C4H、4CL、CHS、F3H、F3'H、FLS、DFR、ANR、LAR、UFGT、3-OMT、CCoAOMT、HCT)。
　　CTS+La+MeJA處理組和對照組兩個(gè)紅松轉(zhuǎn)錄樣本進(jìn)行差異表達(dá)分析，篩選出5713條差異表達(dá)unigene，其中

9、3449條unigene為表達(dá)上調(diào)，2264條unigene為表達(dá)下調(diào)，主要參與核糖體途徑、生化代謝途徑和次生代謝物的生物合成途徑。在差異表達(dá)文庫中篩選出與多酚合成相關(guān)的23條表達(dá)上調(diào)unigene編碼多酚合成途徑中8個(gè)功能基因
　　（PAL、4CL、CHS、F3H、DFR、ANR、LAR和UFGT）。將這8個(gè)功能基因進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證和表達(dá)分析，誘導(dǎo)子(CTS、MeJA、La、CTS+La+MeJA)均可誘導(dǎo)8種功能基因顯著表

10、達(dá)，其中轉(zhuǎn)錄水平變化最大的為CHS，其次為ANR和LAR。初步證實(shí)CHS、ANR、LAR為紅松多酚合成的關(guān)鍵功能基因。CTS+La+MeJA組合誘導(dǎo)紅松細(xì)胞CHS、ANR、LAR的上調(diào)表達(dá)最為顯著，分別是對照組的185、25、21倍。CTS+La+MeJA誘導(dǎo)提高總酚和總原花青素含量的同時(shí)，還可以顯著提高兒茶素、表兒茶素、原花青定B2和花旗松素4種單體酚的含量。CTS+La+MeJA誘導(dǎo)多酚合成關(guān)鍵酶基因CHS、ANR、LAR的高表達(dá)與