葡萄細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)及誘導(dǎo)子對(duì)懸浮細(xì)胞多酚產(chǎn)量影響的研究.pdf

1、利用懸浮培養(yǎng)提高植物次生代謝物的產(chǎn)量，是生產(chǎn)某些次生代謝物的新方法。本實(shí)驗(yàn)利用鮮食葡萄巨峰，釀酒葡萄赤霞珠、黑比諾作為材料，以B5培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基通過(guò)調(diào)整培養(yǎng)基的配比和激素濃度建立起了穩(wěn)定的細(xì)胞懸浮體系，優(yōu)化了細(xì)胞懸浮培養(yǎng)條件。通過(guò)在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過(guò)程中的不同時(shí)期添加不同濃度的外源誘導(dǎo)物質(zhì)，蔗糖、苯丙氨酸。茉莉酸甲酯和紫外光(UV-C)處理，研究了誘導(dǎo)子對(duì)巨峰葡萄懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)和總酚、花青素、白藜蘆醇產(chǎn)量的影響。為利用細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行次生代

2、謝物的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。 本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果如下： 1.建立了穩(wěn)定的葡萄細(xì)胞懸浮體系選擇了適合葡萄愈傷組織產(chǎn)生和進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的激素濃度及配比、pH、蔗糖濃度等。不同的葡萄品種誘導(dǎo)愈傷組織和懸浮培養(yǎng)所需要的激素濃度與組合是不同的。以B5+250mg·L-1水解酪蛋白+0.1mg·L-1NAA+0.2mg·L-1KT+30g·L-1蔗糖+6g·L-1瓊脂為誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基，三種材料均能建立起適合愈傷組織生長(zhǎng)的培

3、養(yǎng)體系。以B5+1.0mg·L-1NAA+0.5 mg·L-16-BA+30g-L-1蔗糖組成的液體培養(yǎng)基能建立起適合巨峰生長(zhǎng)的細(xì)胞懸浮體系。以B5+250 mg·L-1水解酪蛋白+2.0mg·L-12,4-D+0.2 mg·L-1KT+1％PVP+30g·L-1蔗糖組成的培養(yǎng)基能建立起適合赤霞珠生長(zhǎng)的懸浮細(xì)胞系。以B5+1.0 mg·L-1NAA+0.5mg·L-1 6-BA+0.2％PVP+30g·L-1蔗糖組成的培養(yǎng)基能建立起適合

4、黑比諾生長(zhǎng)的懸浮細(xì)胞系。從生長(zhǎng)狀況來(lái)看，三種材料的愈傷組織和懸浮細(xì)胞生活力均為巨峰>赤霞珠>黑比諾。巨蜂葡萄的懸浮細(xì)胞呈粘稠、均一、穩(wěn)定的黃白色，以單個(gè)細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)的形式存在，適合進(jìn)行誘導(dǎo)處理；釀酒葡萄赤霞珠和黑比諾的懸浮細(xì)胞主要以單個(gè)細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)的形式存在，底部存在有少量的的組織團(tuán)塊，顏色較深，易褐化。 2.選擇了適合懸浮培養(yǎng)的繼代方法選取連續(xù)繼代數(shù)次(3次以上)的新鮮、松軟易碎的黃白色愈傷組織15.20g，放入裝有40m

5、l液體培養(yǎng)基的100ml三角瓶中，25℃下120rpm，黑暗條件下?lián)u床上振蕩培養(yǎng)，24h后將葡萄細(xì)胞懸浮液靜置，將上層培養(yǎng)基連同單細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)一起轉(zhuǎn)移到滅過(guò)菌的空三角瓶中繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，棄去大的組織團(tuán)塊及大的細(xì)胞團(tuán)。3-4d后視情況用同樣的方法再轉(zhuǎn)移一次。一周后將已經(jīng)粘稠的、正處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞加入其體積一半的液體培養(yǎng)基稀釋?zhuān)^續(xù)振蕩培養(yǎng)。達(dá)到一定體積后轉(zhuǎn)移到大的三角瓶中，用同樣的方法繼續(xù)添加培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)。直到達(dá)到一定數(shù)量的均一穩(wěn)定

6、的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)液。在以后的繼代過(guò)程接種量每40mL只要5～10g之間就可以快速建立起生長(zhǎng)穩(wěn)定的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系． 3.探索了防止和減輕懸浮細(xì)胞褐化的方法通過(guò)對(duì)愈傷組織的挑選、接種量的控制、轉(zhuǎn)瓶、PVP和大孔吸附樹(shù)脂的利用以及挽救等措施，探索了防止和減輕懸浮細(xì)胞褐化的方法。 4.誘導(dǎo)處理對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響各種誘導(dǎo)處理對(duì)懸浮細(xì)胞生物量的增加都沒(méi)有促進(jìn)作用，相反誘導(dǎo)處理之后懸浮細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)或輕或重的褐化現(xiàn)象。 5.蔗糖對(duì)巨

7、峰懸浮細(xì)胞多酚合成的影響不同濃度的蔗糖對(duì)懸浮細(xì)胞總酚的含量都有提高作用，并且總酚含量隨著蔗糖濃度的增加而增加，但是蔗糖濃度越高褐化越嚴(yán)重。而蔗糖的添加對(duì)花青素的含量影響不大，30g·L-1的蔗糖能輕微提高花青素含量，7.5g·L-1和15g·L-1的蔗糖對(duì)花青素的含量則有輕微抑制作用。對(duì)于白藜蘆醇，適當(dāng)濃度的蔗糖對(duì)其含量有提高作用，濃度過(guò)高則有抑制作用。15g·L-1的蔗糖能顯著提高白藜蘆醇的含量。 6.苯丙氨酸對(duì)巨峰懸浮細(xì)胞多

8、酚合成的影響苯丙氨酸的添加能顯著提高總酚、花青素和白藜蘆醇的含量。 7.茉莉酸甲酯的添加對(duì)總酚和白藜蘆醇的含量都有促進(jìn)作用，但對(duì)花青素的含量有輕微的抑制作用。 8.紫外光處理對(duì)巨峰懸浮細(xì)胞多酚合成的影響一定強(qiáng)度的紫外光UV-C處理能提高懸浮細(xì)胞的多酚含量。在紫外燈(直徑D=2.5cm，長(zhǎng)度L=88 cm，功率P=30W，λ=254nm)放在距懸浮細(xì)胞35cm處照射強(qiáng)度為41.5μW·cm-2也條件下照射2h，總酚、花青素