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文檔簡介
1、論文以不同品種枇杷為試驗材料,以誘導(dǎo)的愈傷組織狀態(tài)以及愈傷含有的Ursolic Acid(UA)及Oleanic acid(OA)含量為指標(biāo),選擇適宜枇杷細胞懸浮培養(yǎng)的品種、外植體以及適宜的激素配比,建立良好的愈傷組織誘導(dǎo)與繼代體系。將該愈傷組織轉(zhuǎn)入液體進行振蕩培養(yǎng),初步建立枇杷細胞懸浮培養(yǎng)系,并在此基礎(chǔ)上優(yōu)化,建立適宜枇杷細胞生長及UA、OA含量積累的培養(yǎng)體系。主要結(jié)果如下:
1、枇杷優(yōu)良愈傷組織的獲得及繼代培養(yǎng)
2、試驗從枇杷品種、外植體部位、激素配比、顯微觀察方面研究,獲得枇杷懸浮培養(yǎng)適宜的愈傷,結(jié)果表明:最適宜枇杷細胞懸浮培養(yǎng)及UA、OA含量積累的枇杷品種為早鐘6號,雖然含有的UA、OA含量較低(6.898、2.343mg/g.DW),但其誘導(dǎo)率高(83.697%)、愈傷組織嫩黃、疏松、顆粒明顯,為最適枇杷品種。最適外植體為幼胚,花絲誘導(dǎo)率雖高(接近100%),但質(zhì)地堅硬;葉片及莖尖的誘導(dǎo)率低;而幼胚誘導(dǎo)的愈傷組織,誘導(dǎo)率(83.17%)較高。
3、同時幼胚誘導(dǎo)的愈傷組織的UA及OA(5.099、1.617mg/g.DW)顯著高于花絲、葉片、莖尖,為最佳外植體。最合適的幼胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1.0mg/L2,4-D+0.5mg/L KT,繼代培養(yǎng)基為MS+0.5mg/L2,4-D+0.25mg/LKT。顯微觀察也表明幼胚誘導(dǎo)的愈傷組織最適用于枇杷懸浮培養(yǎng)。同時,試驗鑒于花絲誘導(dǎo)的優(yōu)越性,對花絲愈傷組織進行調(diào)控,調(diào)控兩代后出現(xiàn)細軟、嫩黃的愈傷組織,但繼代兩三次后愈傷組織轉(zhuǎn)白,水漬化,
4、狀態(tài)不佳,有待進一步研究。
2、枇杷細胞懸浮培養(yǎng)體系建立
在枇杷細胞的液體培養(yǎng)中,細胞生長呈現(xiàn)典型的“S”曲線,培養(yǎng)周期為18d。以細胞FW增長倍數(shù)及UA、OA的增長倍數(shù)為衡量指標(biāo),對懸浮培養(yǎng)體系進行優(yōu)化。結(jié)果表明:懸浮培養(yǎng)最適培養(yǎng)基配方為:MS+NAA0.5mg/L,枇杷細胞鮮重25.863g.FW,為初始3.577倍,UA及OA含量分別為36.490、6.975mg/g.DW,為初始4.744倍、2.881倍。最
5、適接種量80g/L,pH6.0,碳源濃度30g/L,溫度25℃,光照400Lux,轉(zhuǎn)速130r/min,裝液量130mL/250mL。對最適激素的考察可知,生長素NAA>2,4-D>IBA,細胞分裂素KT>BA,且生長素、細胞分裂素的單獨作用效果好于組合作用,及NAA>KT>NAA、KT。同時,試驗研究了誘導(dǎo)子對枇杷細胞生長及UA、OA含量的影響,結(jié)果表明100mg/LMJ的加入為試驗中最適宜的誘導(dǎo)子,鮮重34.65g.FW,UA及OA
6、含量33.089、6.496mg/g.DW,分別為對照CK的1.080、2.540、2.590倍。綜上,試驗建立了適宜的枇杷細胞懸浮培養(yǎng)體系。
3、 UA及OA含量的提取與測定
試驗在枇杷葉UA及OA超聲提取方法的基礎(chǔ)上改良,以95%乙醇為溶劑,對UA、OA的超聲提取方法進行優(yōu)化,得到最適的提取方法為:超聲功率50W、超聲時間25min、料液比1:40、超聲次數(shù)2次。在此方法下,測得枇杷細胞內(nèi)UA及OA的超聲提取率分
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