石榴愈傷組織的誘導和細胞懸浮培養(yǎng)體系的建立.pdf

1、本文以石榴（Punica granatum L）植株為材料，利用植物組織和細胞培養(yǎng)技術，以誘導愈傷組織和建立石榴愈傷組織懸浮培養(yǎng)體系為目的，系統(tǒng)地對石榴愈傷組織的誘導和狀態(tài)調控、分化了的疏松愈傷組織顆粒懸浮培養(yǎng)體系的特點和生長規(guī)律等幾個方面進行研究。使用分光光度法測量石榴不同來源組織的黃酮類化合物含量，為工廠化生產黃酮類化合物提供實驗和理論依據。
　　 愈傷組織的誘導階段，研究了不同外植體類型、不同滅菌條件、不同激素種類和水平對

2、石榴愈傷組織誘導率、疏松程度和褐化率的影響。結果表明：靠近頂端的成熟葉片更容易誘導為疏松愈傷組織，體積分數為75％酒精消毒5s和質量分數為0.1％的升汞消毒4min組合的消毒效果較好，石榴愈傷的最佳誘導培養(yǎng)基激素配方為：MS+1.0 mg/L2.4-D+1.0mg/L6-BA+1.0mg/LNAA。
　　 石榴愈傷組織的繼代過程中，出現(xiàn)愈傷組織生長過于致密，不利于實現(xiàn)懸浮培養(yǎng)，因此獲得疏松、生長快速的愈傷組織是成功實現(xiàn)石榴細胞懸

3、浮培養(yǎng)的前提。研究不同激素種類和水平對疏松愈傷組織的影響。結果表明石榴最佳繼代培養(yǎng)配方為：MS+1.0mg/L2，4-D+0.1mg/LKT。同時確定了石榴愈傷組織在36天的動態(tài)生長曲線，傷組織在這個培養(yǎng)階段內，呈現(xiàn)出“S”型生長周期，第12d進入對數生長期，在培養(yǎng)的第30d，達到細胞生物量的最大值，為6.48g，增長了5.34倍。
　　 建立石榴細胞懸浮培養(yǎng)體系，研究接種量、搖床轉速、蔗糖濃度、裝液量、激素配方、培養(yǎng)過程中pH

4、的變化等因素對細胞懸浮培養(yǎng)體系的影響。同時還對懸浮培養(yǎng)中細胞動態(tài)生長曲線的測定和黃酮類化合物的積累做了部分研究。
　　 本文得出石榴細胞懸浮培養(yǎng)的最佳條件如下：以MS基本培養(yǎng)基的成分和含量為標準，配制成液體培養(yǎng)基，調節(jié)蔗糖濃度為3％，即30g/L，培養(yǎng)瓶的裝液量為25mL/150mL，每瓶接種3g愈傷組織，以110rpm的搖床轉速，最佳激素配方為：MS+1.0mg/L2，4-D+0.1 mg/L KT。在以上條件下進行培養(yǎng)，懸浮

5、細胞在6d后進入對數生長期，在21d細胞生物量達到最大值，干重達到21.68g/L。21d后細胞生物量開始下降，進入生長靜止期，次級生物代謝產物細胞總黃酮含量在此階段出現(xiàn)高峰值，含量為69.05mg/g。在培養(yǎng)過程中pH值有變化，先降低，后有升高趨勢。
　　 用分光光度法，對定期采收的石榴皮、石榴葉和固體培養(yǎng)中的石榴愈傷組織、液體培養(yǎng)中的細胞，測量其總黃酮含量，并分析在不同時間的變化趨勢。結果表明：石榴皮的總黃酮含量隨時間變化而