刀豆組織懸浮培養(yǎng)體系的建立及刀豆氨酸的誘導(dǎo)、分離提取.pdf

1、刀豆氨酸是一種天然的非蛋白質(zhì)堿性氨基酸，等電點(diǎn)為8.2，極易溶于水，存在于一些豆類中合成的非蛋白質(zhì)的堿性L-α-氨基酸，具有一定的毒性、抗腫瘤性和抗代謝性。刀豆氨酸的制備方法主要有兩種：一種是化學(xué)合成法，一種是生物提取法，后者較前者操作簡(jiǎn)單。L-刀豆氨酸被認(rèn)為是一種潛在的生物殺蟲劑，由于其為貯氮化合物，可作為一種肥料，另外刀豆氨酸具有低毒性，對(duì)自然環(huán)境無污染，因此具有很高的研究價(jià)值。在國內(nèi)對(duì)從植物組織中提取刀豆氨酸的報(bào)道目前較少，陳東芳

2、發(fā)現(xiàn)L-刀豆氨酸與2，4-二硝基氟苯在硼砂緩沖液會(huì)出現(xiàn)特殊顏色反應(yīng)。目前L-刀豆氨酸與2，4-二硝基氟苯在硼砂緩沖液中的反應(yīng)是提取刀豆氨酸最簡(jiǎn)單、最快速的一種試驗(yàn)方法。通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在多種氨基酸存在的情況下，這一顏色反應(yīng)靈敏度不高，初步推測(cè)其原因?yàn)镈NFB與其他氨基酸的結(jié)合能力比跟刀豆氨酸結(jié)合的能力要強(qiáng)，并且陳東芳未對(duì)反應(yīng)中涉及的試劑進(jìn)行光譜掃描和復(fù)合物穩(wěn)定性測(cè)定。本論文主要以刀豆氨酸的鮮重、刀豆氨酸含量及尿素含量為考察指標(biāo)，進(jìn)行了多因素

3、多水平的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，建立懸浮培養(yǎng)體系，并用化學(xué)因素和物理因素進(jìn)行誘導(dǎo)，以便提高提取刀豆氨酸的效率。
　　 研究結(jié)果表明：
　　 (1)研究刀豆氨酸的提取及2，4-二硝基氟苯與刀豆氨酸在pH9.5硼砂緩沖溶液中反應(yīng)的最佳條件，進(jìn)而優(yōu)化測(cè)定刀豆氨酸的方法。運(yùn)用分光光度法測(cè)定2，4-二硝基氟苯與刀豆氨酸的復(fù)合物在571nm處的吸光值。結(jié)果表明，刀豆氨酸水提取法效果最好，DNFB-乙腈的用量為30μL時(shí)，刀豆氨酸與DNFB反應(yīng)的復(fù)

4、合物在571nm處有最大吸收值。在30min內(nèi)穩(wěn)定以后該復(fù)合物的OD值隨著時(shí)間的增長而增加，對(duì)應(yīng)線性回歸方程為y=0.0083x-0.052，相關(guān)系數(shù)R2=0.9986。
　　 (2)組織懸浮培養(yǎng)過程中愈傷組織生長曲線大致呈“S”型，生長周期為18d，分為延遲期、指數(shù)期和穩(wěn)定期。開始細(xì)胞適應(yīng)新環(huán)境愈傷組織增重緩慢，在培養(yǎng)的12～18d細(xì)胞迅速分裂和生長，第18～21d由于培養(yǎng)基中有害物質(zhì)的積累以及養(yǎng)分的耗盡細(xì)胞增重緩慢。刀豆氨酸

5、含量呈先稍有下降后上升，最后又下降的趨勢(shì)。
　　 (3)研究了刀豆懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長曲線及在刀豆愈傷組織懸浮培養(yǎng)過程中，添加不同的蔗糖量、6-BA量、NAA量對(duì)刀豆懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長及合成刀豆氨酸和尿素含量的影響。結(jié)果表明：蔗糖30g/L時(shí)最適合細(xì)胞生長，組織達(dá)到最大值9.02g，蔗糖為20g/L時(shí)最有利于刀豆氨酸的合成在第18天時(shí)達(dá)到最大值；6-BA為4.0mg/L時(shí)細(xì)胞鮮重和尿素含量在第18天時(shí)達(dá)到最大值，6-BA為2.0m

6、g/L時(shí)懸浮培養(yǎng)液中刀豆氨酸在第18天時(shí)達(dá)到最大值；NAA濃度為1.0mg/L時(shí)最適宜細(xì)胞的生長以及刀豆氨酸的生產(chǎn)。
　　 (4)運(yùn)用兩步培養(yǎng)法，根據(jù)生長培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接到生產(chǎn)培養(yǎng)的時(shí)間，得出在第12天轉(zhuǎn)接時(shí)，刀豆氨酸含量及尿素含量足最大的。用茉莉酸甲酯和二氫茉莉酮酸甲酯對(duì)刀豆懸浮培養(yǎng)組織進(jìn)行誘導(dǎo)，向刀豆細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系中分別添加40μmol/L茉莉酸甲酯和20μmol/L二氫茉莉酮酸甲酯時(shí)，細(xì)胞中刀豆氨酸產(chǎn)量最高。
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7、5)運(yùn)用超聲波、光照等因素對(duì)刀豆懸浮培養(yǎng)進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果表明：60Hz時(shí)刀豆氨酸含量及尿素含量達(dá)到最大值，在60Hz下，第9天對(duì)植物組織進(jìn)行超聲產(chǎn)生的刀豆氨酸含量及尿素含量最好：平均光照12小時(shí)下的培養(yǎng)基產(chǎn)出刀豆氨酸含量和尿素含量明顯多于0小時(shí)光照和24小時(shí)光照的培養(yǎng)基。
　　 (6)刀豆氨酸水提取法效果最好，提取量最大；本實(shí)驗(yàn)采用732陽離子交換樹脂為分離方法，以氨水為洗脫劑分離純化刀豆氨酸，結(jié)果表明氨水的最適濃度為3mol/L