己烯雌酚抑制刀豆蛋白A誘導(dǎo)的小鼠急性自身免疫性肝炎.pdf

1、目的：免疫系統(tǒng)是機(jī)體參與內(nèi)外環(huán)境相互作用、相互調(diào)節(jié)的重要系統(tǒng)。正常免疫系統(tǒng)可以識別“自我”與“非我”，對異源性抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)，對自身抗原則耐受，這對于機(jī)體維持自身內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)有著重要的作用，既可以消除致病原，又不至于過強(qiáng)損傷自身組織器官。機(jī)體內(nèi)的免疫系統(tǒng)內(nèi)存在著正負(fù)調(diào)控機(jī)制，既可引起炎癥反應(yīng)，同時不損害自身組織器官。機(jī)體的炎癥免疫應(yīng)答，是屬于生物學(xué)里經(jīng)典的正反應(yīng)調(diào)控機(jī)制。從抗原的識別、呈遞、免疫細(xì)胞的激活以及免疫細(xì)胞的免疫反應(yīng)、補(bǔ)體系統(tǒng)

2、等均存在信息放大的生學(xué)特征。同時，系統(tǒng)內(nèi)還存在負(fù)調(diào)控機(jī)制，其涉及到免疫細(xì)胞的激活，抗體、補(bǔ)體及細(xì)胞因子的激活等過程，以防止反應(yīng)過強(qiáng)損傷自身組織器官。我們所熟知的免疫抑制性細(xì)胞因子IL-10、TGF-β等均屬于此類范疇。近幾年隨著分子免疫學(xué)的發(fā)展，對免疫細(xì)胞的分類及識別有了更深的認(rèn)識，現(xiàn)在認(rèn)為機(jī)體內(nèi)除了具有引起免疫反應(yīng)，造成免疫殺傷作用的免疫細(xì)胞外，還存在抑制免疫反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞。骨髓來源的抑制性細(xì)胞(Myeloid-derivedSu

3、ppressor Cells，MDSCs)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(RegulatoryT cells，Tregs)是體內(nèi)兩種主要的免疫抑制性細(xì)胞。在腫瘤以及自身免疫性疾病患者體內(nèi)這兩種細(xì)胞參與了重要的免疫調(diào)控作用，影響疾病的發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后。除去自身系統(tǒng)內(nèi)的調(diào)節(jié)，免疫系統(tǒng)同時還受到機(jī)體其他系統(tǒng)的調(diào)控，目前有學(xué)者提出了神經(jīng)精神-內(nèi)分泌-免疫功能軸的概念。神經(jīng)精神、內(nèi)分泌、免疫是機(jī)體三大調(diào)控系統(tǒng)，除在各自系統(tǒng)內(nèi)調(diào)控應(yīng)對機(jī)體內(nèi)外環(huán)境的變化外，他們之間

4、還著相互調(diào)節(jié)，影響對方的調(diào)節(jié)功能1。神經(jīng)精神-內(nèi)分泌-免疫系統(tǒng)是機(jī)體內(nèi)最大的調(diào)控系統(tǒng)，是機(jī)體與外界環(huán)境的主要反應(yīng)系統(tǒng)。它涉及到神經(jīng)、內(nèi)分泌以及免疫三大系統(tǒng)。在此，我們主要研究的是前二者對于免疫系統(tǒng)的影響。神經(jīng)系統(tǒng)各神經(jīng)元通過分泌各種神經(jīng)細(xì)胞因子以及直接電生理作用，傳遞生物信息，調(diào)節(jié)其下游的功能。而其分泌的神經(jīng)細(xì)胞因子部分被證明與細(xì)胞因子有類似的結(jié)構(gòu)，且可以作用于細(xì)胞因子受體，從而介導(dǎo)免疫作用。同樣，內(nèi)分泌系統(tǒng)通過分泌多種激素影響免疫系統(tǒng)

5、功能，最為人們所熟知的是應(yīng)激狀態(tài)下皮質(zhì)激素對于免疫系統(tǒng)的抑制作用。近些年，由于對于免疫機(jī)制研究的深入，許多人開始關(guān)注性激素對于免疫系統(tǒng)的作用，尤其是在自身免疫性疾病、腫瘤、創(chuàng)傷患者以及器官移植后患者免疫功能的變化等方面。從一個完整的機(jī)體方面，外環(huán)境變化后，通過影響神經(jīng)精神以及內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響，從而達(dá)到對于機(jī)體免疫系統(tǒng)的影響，共同應(yīng)對環(huán)境的變化。自身免疫性肝炎是一種常見的自身免疫性疾病，其發(fā)病多為隱匿，進(jìn)行性發(fā)展，其臨床表現(xiàn)為血清轉(zhuǎn)氨酶升

6、高、自身抗體陽性、肝臟淋巴細(xì)胞浸潤，后期肝小葉重塑，發(fā)展為肝硬化，這是歐美國家造成肝硬化的主要病因之一。目前對于該病的機(jī)制并不清楚，臨床已缺乏有效地治療藥物，肝硬化終末期，多需要人工肝移植。同其他自身免疫性疾病類似，自身免疫性肝炎的發(fā)生有明顯的性別差異，男女比例通常為1∶4，且在女性患者中，其發(fā)生有明顯的年齡依賴性。該病在女性有二個主要的發(fā)病高峰，18歲以前或者40歲絕經(jīng)以后，有學(xué)者認(rèn)為這與不同年齡層女性體內(nèi)性激素的水平變化有關(guān)系。關(guān)于

7、雌激素與自身免疫性疾病的關(guān)系，目前并沒有得到統(tǒng)一的定論。許久之前，就有學(xué)者發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)在大部分自身免疫性疾病上，女性似乎較男性更易患自身免疫性疾病，但是其具體的機(jī)制并不是十分清楚。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，女性較男性更易接種疫苗，女性的免疫反應(yīng)似乎較男性要強(qiáng)，這似乎可以解釋女性發(fā)病率較高的問題。但是，同時，有人發(fā)現(xiàn)許多女性患者如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)硬化的患者，在懷孕后癥狀多有好轉(zhuǎn)，而生產(chǎn)后，多有復(fù)發(fā)，說明一定較高水平的雌激素對于自身免疫性疾病有保護(hù)作用。

8、但是，系統(tǒng)性紅斑狼瘡的患者，懷孕后多有加重，與上訴結(jié)論矛盾。近幾年又有許多關(guān)于雌激素對于自身免疫性疾病的作用，但是，目前其與自身免疫性肝炎的關(guān)系，目前仍不清楚。雌激素對于不同自身免疫性疾病可能作用不同，這可能與自身免疫性疾病的發(fā)生機(jī)制有關(guān)。不同的類型的自身免疫性疾病介導(dǎo)其發(fā)生的機(jī)制不同。目前，有許多的學(xué)者關(guān)注于，早期抗原呈遞的過程。免疫反應(yīng)的發(fā)生，多是從抗原的呈遞開始，經(jīng)過樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞處理后呈遞給CD4+T淋巴細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞通

9、過表面的TCR以及抗原識別位點，識別抗原，激活輔助T淋巴細(xì)胞，促使其向不同輔助T細(xì)胞亞型分化，通過分泌細(xì)胞因子或者細(xì)胞間相互作用，激活下游的B細(xì)胞產(chǎn)生抗體介導(dǎo)體液免疫，或者CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞免疫。不同種類的自身免疫性疾病，其自身的抗體呈遞方式亦不同。目前認(rèn)為多發(fā)性硬化、自身免疫性肝炎以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者，主要是由Th1介導(dǎo)的免疫反應(yīng)導(dǎo)致的，而系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者，則被認(rèn)為主要是由Th2介導(dǎo)的免疫反應(yīng)所致。雌激素在體外，被發(fā)現(xiàn)可以抑

10、制Th1介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，但對于Th2介導(dǎo)的反應(yīng)則有加強(qiáng)的作用。所以者不難理解，懷孕期間隨著機(jī)體內(nèi)雌激素水平的升高，Th1多發(fā)硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)患者癥狀好轉(zhuǎn)，但是系統(tǒng)性紅斑狼瘡的患者癥狀反而有加重的趨勢。己烯雌酚（diethylstilbestrol，DES）是一種人工合成的非甾體類雌激素類似物(synthetic)。其結(jié)構(gòu)類似于雌二醇，進(jìn)入機(jī)體后可以結(jié)合雌激素受體，發(fā)揮類似于雌二醇的作用，早期被用于替代雌二醇以緩解孕期反應(yīng)，防止流產(chǎn)以及

11、激素平衡失調(diào)引起的功能性出血、閉經(jīng)等。近些年發(fā)現(xiàn)，DES作為雌二醇的類似物，可以替代雌激素的作用，補(bǔ)充體內(nèi)雌激素的不足或者迅速降低引起的一系列癥狀。目前，在臨床上發(fā)現(xiàn)，DES在圍絕經(jīng)期以及絕經(jīng)后期婦女骨質(zhì)疏松上的療效明顯，同其他雌激素類被認(rèn)為是治療骨質(zhì)疏松最有效的藥物，被廣泛應(yīng)用于中老年女性。另外，對于雌激素敏感的前列腺癌患者，DES可以抑制前列腺癌的發(fā)生與轉(zhuǎn)移，達(dá)到化學(xué)輔助治療的作用。目前臨床上DES仍舊用于晚期前列腺癌、乳腺癌、閉經(jīng)

12、以及終止妊娠引產(chǎn)等。本課題的研究目的是探討己烯雌酚，一種人工合成的非甾體類雌激素，對T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性肝炎的保護(hù)作用，希望為該疾病的機(jī)制探討和臨床診治提供新思路。
　　 方法：首先，探討的是乙烯雌酚(Diethylstilbestrol，DES)在體外對于成熟T細(xì)胞增殖的影響。取出雌性成年C57B/L6野生型小鼠脾臟，提取脾臟淋巴細(xì)胞后，在96孔板內(nèi)培養(yǎng)，2.5ug/mL刀豆蛋白A(Concanavalin A，conA)處

13、理活化T淋巴細(xì)胞，加入不同劑量DES，37℃，5％ CO2，孵箱內(nèi)共同培養(yǎng)24小時或48小時，最后的8小時加入3H-thymindine2 ci/well，共同培養(yǎng)，結(jié)果表明在DES等于或高于20uM DES濃度時，可明顯抑制2.5ug/mL conA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖。這個實驗說明DES在體外特定的濃度下可以抑制模擬炎癥發(fā)生的淋巴細(xì)胞的增殖作用，從側(cè)面反應(yīng)DES對機(jī)體免疫反應(yīng)可能具有抑制作用，對于炎癥、自身免疫性疾病以及移植后排斥的患

14、者可能具有潛在的藥用價值。其次，我們開始體內(nèi)試驗。我們選擇的是conA誘導(dǎo)的小鼠急性自身免疫性肝炎模型。conA作為一種分裂原刺激物，給注射動物后可以引起動物的T細(xì)胞明顯增殖，從而被用來模擬體內(nèi)炎癥反應(yīng)。腹腔注射conA可以誘導(dǎo)自發(fā)性腹膜炎，靜脈單獨注射或者加用D-gal可向肝臟炎癥方向誘導(dǎo)，表現(xiàn)為肝臟淋巴細(xì)胞浸潤、肝組織損傷、轉(zhuǎn)氨酶升高等肝炎癥狀，由于其早期主要的浸潤細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞以及NK細(xì)胞，所以被認(rèn)為是T細(xì)胞介導(dǎo)的肝炎，是較為成

15、熟和穩(wěn)定的自身免疫性肝炎模型。我們選用的動物仍然是雌性成年C57B/L6野生型小鼠。實驗分為四組，未處理對照組(Naive)、對照肝炎組(Vehicle，Veh)、DES治療組(DES treatment)以及DES單獨處理組(DES only)，每組5只小鼠。治療組以及DES單獨組對于小鼠進(jìn)行DES預(yù)處理，誘導(dǎo)前第1、2天皮下注射DES（溶于玉米油內(nèi)），對照肝炎組注射等體積玉米油作對照，未處理組不作處理。誘導(dǎo)當(dāng)天，配制conA2.5m

16、g/mL，肝炎對照組以及DES治療組每只小鼠每公斤體重經(jīng)靜脈注射12.5mg conA，未處理對照組以及DES單獨組注射登劑量的注射用生理鹽水作對照。誘導(dǎo)后1.5小時、6小時、12小時、24小時等時間點抽血分離血清，測血清轉(zhuǎn)氨酶水平以及血清中細(xì)胞因子的水平，8小時、24小時終止誘導(dǎo)模型，取出肝臟組織，分離肝臟內(nèi)浸潤的免疫細(xì)胞做細(xì)胞流式分析;提取肝臟內(nèi)單核細(xì)胞的蛋白進(jìn)行western blot觀察具體分子的表達(dá);取肝臟組織做肝臟組織固定做

17、切片進(jìn)行組織學(xué)分析。結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)在特定濃度的DES處理下，conA誘導(dǎo)的小鼠自身免疫性肝炎，血清轉(zhuǎn)氨酶明顯的降低，血清促炎因子（Th1為主）下降，H&E染色顯示肝臟浸潤細(xì)胞減少、壞死灶減少，肝臟細(xì)胞凋亡減少;提取肝臟浸潤的單核細(xì)胞，進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其中T淋巴細(xì)胞降低，單核細(xì)胞減少;而免疫抑制性細(xì)胞Tregs以及MDSCs則增多。以上說明DES對于conA誘導(dǎo)的自身免疫性肝炎有保護(hù)作用。另外對于肝細(xì)胞的凋亡，我們選用早期8小時終止誘

18、導(dǎo)。組織固定后切片，進(jìn)行細(xì)胞細(xì)胞凋亡實驗—Tunnel Assay，結(jié)果顯示治療組肝組織細(xì)胞的熒光明顯較肝炎組弱，說明DES可以抑制自身免疫性肝炎中肝細(xì)胞的凋亡，也說明其對于誘導(dǎo)的小鼠肝炎有保護(hù)作用。為驗證DES對于Treg細(xì)胞的影響，我們選擇Foxp3-EGFP Knock-in小鼠，分離出其脾臟淋巴細(xì)胞，利用細(xì)胞分選儀，分選出的Foxp3+-EGFP細(xì)胞(Tregs)，在96孔板內(nèi)培養(yǎng)，加入不同劑量的DES，37℃，5％ CO2，孵

19、箱內(nèi)共同培養(yǎng)48小時，最后的8小時加入3H-thymindine2 ci/well，共同培養(yǎng)，檢測其放射性，結(jié)果表明DES在5uM以及20uM時，可以明顯增加Tregs的增殖。由此，體外實驗同樣證實DES可以增加Tregs。
　　 結(jié)論：本實驗結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)雌激素的合成類似物DES可以抑制小鼠自身免疫性肝炎。用它來模擬雌激素在體內(nèi)對于自身免疫性肝炎的作用，以說明雌激素對于自身免疫性肝炎的保護(hù)性作用。同時，由于在女性體內(nèi)周期性或者

20、不同的年齡階段雌激素表現(xiàn)為不同的激素水平，這對于研究機(jī)體自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制也提供可另外一個新的研究方向。發(fā)現(xiàn)DES可以減少自身免疫性肝炎小鼠肝臟浸潤的淋巴細(xì)胞，減少血清促炎細(xì)胞因子（Th1為主），增加抑制性Treg細(xì)胞以及MDSCs。說明雌激素可能通過增加體內(nèi)免疫抑制性細(xì)胞Tregs細(xì)胞以及MDSCs，抑制Th1細(xì)胞因子的分泌，抑制自身免疫性肝炎的發(fā)生。證實雌激素可能通過復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，參與到自身免疫性肝炎的發(fā)生與發(fā)展過程中，