MSCs多次移植治療小鼠自身免疫性肝炎的療效和機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　自身免疫性肝炎(AIH)是一種免疫介導(dǎo)的慢性肝臟炎癥性疾病，以血清轉(zhuǎn)氨酶和免疫球蛋白G(IgG)升高，自身抗體陽(yáng)性，界面性肝炎為特征。研究發(fā)現(xiàn)它與環(huán)境誘發(fā)、免疫耐受打破、遺傳易感性等有關(guān)，這些因素共同誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)肝臟抗原的T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫侵害作用。其發(fā)病隱秘，通常以非特異性癥狀起病，嚴(yán)重病例可快速進(jìn)展為肝硬化和肝衰竭。單獨(dú)皮質(zhì)類(lèi)固醇或者低劑量與硫唑嘌呤結(jié)合治療改善大部分病人的癥狀及肝臟炎癥的實(shí)驗(yàn)室和組織學(xué)表現(xiàn)。然而該治

2、療不一定都有效，且其藥物依賴(lài)性及副作用嚴(yán)重影響病人生活質(zhì)量。
　　間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)是多向成體干細(xì)胞，具有自我更新和多向分化潛能。MSCs能修復(fù)組織損傷、抑制免疫細(xì)胞活化和增殖、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。MSCs作為免疫調(diào)節(jié)劑用于治療已在器官移植、阻止移植物抗宿主病和自身免疫性疾病如炎癥性腸病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化等方面進(jìn)行探索。然而MSCs對(duì)自身免疫性肝炎的療效問(wèn)題研究的較少。
　　在先前的研究中，發(fā)現(xiàn)同種異體骨髓間充質(zhì)干

3、細(xì)胞移植對(duì)小鼠自身免疫性肝炎具有治療作用，現(xiàn)在重點(diǎn)討論多次干細(xì)胞移植的療效，并通過(guò)觀察自身免疫性肝炎小鼠模型中及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植干預(yù)后程序性死亡配體1(PD-L1)和白介素17(IL-17)的表達(dá)情況來(lái)探討其可能的機(jī)制。
　　方法:
　　健康雄性C57BL/6小鼠，10-12周齡，在第0天和第7天腹腔注射同系小鼠肝臟勻漿S-100與弗氏完全佐劑的乳化液，第21天血生化檢測(cè)和肝臟組織病理學(xué)觀察鑒定模型是否成功。
　　

4、取出凍存的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞，復(fù)蘇培養(yǎng)后，用0.25％胰蛋白酶消化，之后使細(xì)胞懸浮于生理鹽水中，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個(gè)/ml，準(zhǔn)備用于小鼠尾靜脈移植。對(duì)照組6只小鼠。造模小鼠隨機(jī)分為模型組和MSCs移植組。移植組再按照移植次數(shù)分為一次、二次、三次三個(gè)亞組。對(duì)照組小鼠在第0天和第7天腹腔注射1.0ml生理鹽水。模型組小鼠在第21天尾靜脈注射0.1ml生理鹽水。MSCs移植一次組在第21天尾靜脈注射1×105個(gè)MSCs;移植二次組在第21天

5、和第28天分別尾靜脈注射1×105個(gè)MSCs;移植三次組在第21天、28天和35天尾靜脈注射1×105個(gè)MSCs（0.1ml/只）。所有小鼠均在第42天處死，并收集肝臟組織和血清。采用HE和Manson染色觀察肝組織病理變化，根據(jù)Ishark等級(jí)評(píng)分系統(tǒng)評(píng)估肝臟纖維化和壞死炎癥活動(dòng)指數(shù)。血清檢測(cè)ALT和AST水平;采用RT-PCR檢測(cè)各組肝臟PD-L1和IL-17mRNA水平，Western印跡法檢測(cè)各組肝臟PD-L1蛋白表達(dá)情況，EL

6、ISA檢測(cè)肝臟IL-17表達(dá)情況。應(yīng)用SPSS19.0對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較，P＜0.05提示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、成功建立小鼠自身免疫性肝炎模型模型組小鼠血清ALT、AST（ALT和AST分別為97.33±14.39U/L和474.83±31.67U/L）較對(duì)照組(62.33±13.589U/L和176.17±19.104U/L)明顯升高;MSCs移植組較模型組下降，并隨治療次數(shù)逐步下降（移植三次

7、組ALT和AST分別為48±11.225U/L和200.5±23.914U/L。HE染色鏡下觀察示:對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞呈放射狀排列在小葉中央靜脈周?chē)?，匯管區(qū)無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn);模型組小葉中央和匯管區(qū)可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)可見(jiàn)小葉內(nèi)的炎癥損傷和壞死;MSCs移植組組織損傷和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯改善，特別是移植三次組，損傷明顯減輕，僅可見(jiàn)少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　2、肝組織中PD-L1表達(dá)情況模型組PD-L1mRNA水平較對(duì)照組明顯增

8、高(PD-L1/β-actin吸光度比值為1.601±0.161vs.0.930±0.145，P＜0.05)，MSCs移植一次組較模型組下降，但隨著移植次數(shù)增加，其表達(dá)逐漸增加，移植三次組較移植一次組顯著增加(1.809±0.167vs.1.195±0.069)。同樣的，Western blot結(jié)果顯示模型組表達(dá)增多的PD-L1蛋白在MSCs移植組被逆轉(zhuǎn)，隨著移植次數(shù)增多，其表達(dá)增加，移植一次組與三次組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(PD-L1/GA

9、PDH0.633±0.066vs.0.802±0.066, P＜0.05)。
　　3、肝組織中IL-17表達(dá)情況ELISA結(jié)果示與對(duì)照組相比，IL-17蛋白表達(dá)在模型組增高(219.529±33.432 vs.92.313±18.600，P＜0.05)，MSCs移植干預(yù)后，其表達(dá)下降，并且隨著移植次數(shù)增多，其表達(dá)逐漸減低(182.490±34.645，127.743±19.735，94.126±16.923)，這與PD-L1表達(dá)趨

10、勢(shì)相反，表明MSCs可能有通過(guò)促進(jìn)PD-L1的表達(dá)抑制IL-17的產(chǎn)生。IL-17mRNA表達(dá)情況與蛋白相似。
　　結(jié)論:
　　MSCs能改善小鼠自身免疫性肝炎，并且多次治療的療效更佳;在模型組中，PD-L1及IL-17表達(dá)水平升高，提示PD-L1及IL-17的表達(dá)可能參與自身免疫性肝炎的發(fā)生發(fā)展;MSCS多次移植干預(yù)后，肝臟炎癥浸潤(rùn)明顯減輕，PD-L1水平逐漸增加，而IL-17表達(dá)逐漸下降，提示MSCs治療作用可能部分通過(guò)