金線蓮苷治療自身免疫性肝炎的作用和分子機(jī)制研究.pdf

1、目的：探討ConA誘導(dǎo)小鼠自身免疫性肝炎模型中金線蓮苷對AIH的治療作用及作用機(jī)制。
　　方法：（1）建立ConA誘導(dǎo)的小鼠自身免疫性肝炎模型，42只雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為7組：正常組，ConA模型組，水飛薊素陽性藥組（Silymarin50mg/kg），金線蓮苷高劑量組（KD30mg/kg），金線蓮苷中劑量組（KD20mg/kg），金線蓮苷低劑量組（10mg/kg)，陰性對照組（KD30mg/kg），每組6只。每組小鼠

2、連續(xù)口服給藥3d，模型小鼠第3d尾靜脈注射ConA，劑量為20mg/kg。造模后12h處死小鼠，檢測小鼠血清肝功能指標(biāo)（AST和ALT）和血生化指標(biāo)（SOD、MDA、NO、IL-12、IFN-γ）的水平；蘇木精伊紅染色（HE）切片觀察肝臟組織病理變化；細(xì)胞流式測定脾臟和肝臟中CD8+T細(xì)胞、Treg細(xì)胞以及骨髓DC細(xì)胞的表型，綜合評價(jià)金線蓮苷的保肝效果和免疫調(diào)控功能。（2）半體外和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。分離培養(yǎng)小鼠原代脾淋巴細(xì)胞，分別給予KD1

3、0μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml，檢測KD對T細(xì)胞增殖的影響。分離培養(yǎng)小鼠原代骨髓來源的DC細(xì)胞，分別給予KD10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml，并加GM-CSF刺激，檢測KD對DCs功能的影響。培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞、HSC-T6細(xì)胞，檢測KD對巨噬細(xì)胞RAW264.7、肝星狀細(xì)胞HSC-T6增殖的影響，初步研究KD的抗炎及抗纖維化作用。（3）應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和蛋白印跡試驗(yàn)檢測JAK2/ST

4、AT3/SOCS3信號通路在ConA誘導(dǎo)小鼠自身免疫性肝炎中的作用以及對KD治療作用的介導(dǎo)。
　　結(jié)果：（1）ConA誘導(dǎo)小鼠自身免疫性肝炎模型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，KD高、中、低劑量均可顯著的降低血清轉(zhuǎn)氨酶（P<0.01），ELISA測定血清中SOD、MDA、NO、IL-12、IFN-γ含量時(shí)發(fā)現(xiàn)，KD高、中、低劑量均可顯著的升高SOD的濃度和降低MDA、NO、IL-12、IFN-γ的濃度。肝臟HE切片顯示，KD能減少炎癥細(xì)胞的浸潤，改善肝

5、臟損傷。KD抑制DCs的吞噬能力和抗原提呈能力，抑制T淋巴細(xì)胞增殖，降低CD8+T細(xì)胞分化和殺傷功能，上調(diào)Tregs的表達(dá)來發(fā)揮免疫耐受作用。（2）半體外和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，KD各劑量組均能降低 T淋巴細(xì)的增殖，并能抑制DC細(xì)胞的成熟，對RAW264.7細(xì)胞、HSC-T6細(xì)胞的增殖也有明顯的抑制作用。（3）qPCR、Western blot結(jié)果表明，KD抑制JAK2/STAT3的表達(dá)和磷酸化，上調(diào)負(fù)調(diào)控因子SOCS3的表達(dá)。

6、　　結(jié)論：（1）KD對ConA誘導(dǎo)小鼠免疫性肝炎具的治療作用效果顯著，可明顯改善肝功能，上調(diào)SOD、下調(diào)MDA，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)；降低NO、IL-12、IFN-γ的表達(dá)水平，減輕肝臟炎癥反應(yīng)。（2）KD可抑制T細(xì)胞增殖和DCs成熟而降低肝臟部位的免疫反應(yīng)，此外，KD對RAW264.7細(xì)胞、HSC-T6細(xì)胞的增殖的均有一定的抑制作用，提示KD具有抗炎和抗纖維化作用。（3）KD是通過下調(diào)肝臟和脾臟中JAK2/STAT3/SOCS3信號通路發(fā)