金線蓮水提物及金線蓮苷對ConA誘導的免疫性肝炎防治作用的研究.pdf

1、目的：通過體內(nèi)和體外兩種模型，評價金線蓮水提物（Water Extract of Anoectochilus roxburghii，WEAR）及主要成分金線蓮苷（Kinsenoside，Kd）對免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）的治療作用，并進一步探討其作用機制。
　　方法：（1）體外誘導脾細胞實驗：分離培養(yǎng)小鼠原代脾細胞，加入5μg/mLConA溶液誘導其增殖分裂，1h后分別給予WEAR（320*、3

2、20、160、l80、40、20、10、5μg/mL）和Kd（32*、32、16、8、4、2、1、0.5μg/mL）繼續(xù)培養(yǎng)24h，測定細胞上清液TNF-α，IFN-γ和IL-4的含量。其中320*μg/mL和32*μg/mL組以分別考察WEAR和Kd自身對細胞的影響。陽性對照選擇水飛薊素（Silymarin）50μg/mL。
　?。?）體內(nèi)ConA誘導小鼠自身免疫性肝炎實驗：健康雄性Balb/c小鼠隨機分為12組，每組10只，連

3、續(xù)給藥一周，WEAR口服給予40，20，10mg/10g（b.w.）三個劑量，Kd口服給予10，5，2.5mg/10g（b.w.）三個劑量。陰性對照分別為兩種藥物高劑量，以排除藥物本身可能造成的陽性結(jié)果。陽性藥為地塞米松（Dexamethasone,DEXA）0.009mg/10g和水飛薊素（Silymarin）0.5mg/10g，正常組和模型組給予等量的蒸餾水。末次給藥1h后尾靜脈注射0.2mg/10g的ConA溶液，并于6h、24h

4、分批處死小鼠。檢測小鼠血漿肝功能水平（AST和ALT）、蘇木精伊紅染色（HE）切片觀察組織病理學變化、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定血漿中TNF-α，IFN-γ,IL-4,IL-6以及IL-10的水平；TUNEL法測定肝細胞凋亡指數(shù)；免疫組化法測定肝內(nèi)CD4+T和CD8+T細胞的浸潤，綜合評價WEAR和Kd的保肝效果。
　　結(jié)果：（1）體外脾細胞培養(yǎng)結(jié)果顯示，WEAR（80~320μg/mL）和Kd（8~32μg/mL）可呈現(xiàn)劑

5、量依賴性的降低細胞懸液中TNF-α，IFN-γ和IL-4的含量，其中WEAR(320μg/mL、160μg/mL)和Kd(32μg/mL)作用最為明顯（P<0.05）。
　　（2）體內(nèi)實驗采用尾靜脈注射 ConA24h后測定血漿轉(zhuǎn)氨酶時發(fā)現(xiàn)，WEAR和Kd的高、中劑量可顯著的降低血漿轉(zhuǎn)氨酶（P<0.05），且高劑量的WEAR與地塞米松的治療效果相當；ELISA測定血漿中細胞因子TNF-α，IFN-γ,IL-4,IL-6以及IL-1

6、0含量時發(fā)現(xiàn)，模型組各細胞因子均顯著性升高，而給藥組能降低各炎癥因子的含量，尤其以WEAR高、中劑量和Kd高劑量尤為顯著。肝臟HE切片顯示，WEAR和Kd能減少炎癥因子的浸潤和增強對肝實質(zhì)的保護；TUNEL切片也能看出，WEAR和Kd可明顯抑制肝細胞的凋亡；從CD4+T和CD8+T細胞的免疫組化分析，WEAR和Kd可劑量依賴性的降低肝內(nèi)淋巴細胞的浸潤。
　　結(jié)論：（1）體外WEAR和Kd可通過抑制脾細胞對炎癥因子的釋放，發(fā)揮免疫調(diào)