MSCs調(diào)控脾臟CD4+T淋巴細(xì)胞亞群治療小鼠自身免疫性肝炎的研究.pdf

1、目的:自身免疫性肝炎（Autoimmune hepatitis, AIH）是一種病因不明的肝臟慢性炎癥性疾病。臨床上對(duì) AIH的治療主要是使用糖皮質(zhì)激素，其可單獨(dú)使用，效果不明顯的話則需要與免疫抑制劑如硫唑嘌呤聯(lián)合應(yīng)用，但這種治療方案的完全緩解率并不高，且長期服藥存在較多副作用，因此迫切需要尋找和探討新的有效治療方法。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone-marrow-derived mesenchymal stem cells, BMMSCs)

2、是來源于骨髓中的一種多能干細(xì)胞，具有多方向分化的潛能及強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)作用，大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究證實(shí) BMMSCs對(duì)多種自身免疫性疾病都有很好的治療作用。本研究應(yīng)用小鼠 BMMSCs干預(yù)刀豆蛋白 A（ConA）誘導(dǎo)的小鼠 AIH進(jìn)程，一方面進(jìn)一步證實(shí)了 BMMSCs的治療效果，另一方面通過分析小鼠脾臟中 CD4+T淋巴細(xì)胞的活化和亞群比例變化，深入探討 BMMSCs發(fā)揮免疫抑制作用治療 AIH的機(jī)制，為 BMMSCs在臨床上的應(yīng)用提供一

3、些可能的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　經(jīng) C57BL/6小鼠尾靜脈注射相應(yīng)量的ConA以建立 AIH模型小鼠。從三周齡 C57BL/6小鼠的骨髓中體外分離培養(yǎng) BMMSCs并鑒定其表面標(biāo)記分子和成脂成骨分化能力。C57BL/6小鼠隨機(jī)分為三組：MSC治療組，AHI模型小鼠經(jīng)尾靜脈注入 MSCs；磷酸鹽緩沖液（PBS）治療組，AHI模型小鼠經(jīng)尾靜脈注入PBS以及正常對(duì)照組，每組5只。14-16小時(shí)后拉頸處死小鼠。檢測外周血 AL

4、T、AST，進(jìn)行肝臟 knodell評(píng)分。取小鼠脾臟制成細(xì)胞懸液并用流式細(xì)胞分析術(shù)檢測CD4＋T淋巴細(xì)胞活化比例及CD4＋T淋巴細(xì)胞中Treg、Th1、Th2和 Th17細(xì)胞比例變化情況，并計(jì)算 Th17/Treg比值。ELISA檢測外周血中TNF-α、IFN-γ及 IL-4細(xì)胞因子的水平。用q-PCR驗(yàn)證肝臟中 CD4+淋巴細(xì)胞亞群比例變化。應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩組正態(tài)分布資料間的差異。
　　結(jié)果:
　　1. BMMSC

5、s表面特異性抗原 CD44、CD29、Sca-1均為陽性，而 CD45、CD11b、CD31為陰性,茜素紅染色、油紅0染色均呈陽性，均符合 BMMSCs的特征。
　　2. AIH模型小鼠的ALT、AST以及knodell評(píng)分均較正常對(duì)照組均明顯升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。但是，MSC治療組的ALT、AST以及knodell評(píng)分均優(yōu)于PBS治療組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　3.與正常對(duì)照組相比

6、， PBS治療組脾臟中 CD4＋T淋巴細(xì)胞活化比例， CD4＋T淋巴細(xì)胞中 Th1、Th2細(xì)胞所占比例及其外周血中細(xì)胞因子（TNF-α、IFN-γ及 IL-4）水平，Th17/Treg比值均顯著升高，以上差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　　4.經(jīng)MSCs治療后，MSC治療組與PBS治療組比較，脾臟CD4＋T淋巴細(xì)胞活化比例無差異（P=0.95），但CD4＋T淋巴細(xì)胞中Th1、Th2細(xì)胞所占比例及其分泌到外周血中的細(xì)胞因子（

7、TNF-α、IFN-γ及IL-4）水平，Th17/Treg比值均顯著降低，以上差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。MSC治療組脾臟中Th17/Treg比值與正常組無差別（p=0.24）。
　　5.肝臟內(nèi) CD4+T淋巴細(xì)胞亞群比例變化趨勢跟脾臟內(nèi)的變化趨勢相同。與正常組比較，PBS治療組肝臟中 Th1、Th2、Th17細(xì)胞比例均有明顯升高趨勢， Treg亦有升高。與 PBS治療組相比，MSC治療組肝臟中 Th1、Th2、Th17

8、細(xì)胞比例呈明顯下降趨勢，但Treg上升趨勢明顯。
　　結(jié)論:
　　1.采用全骨髓貼壁法得到的小鼠 BMMSCs具有成脂、成骨能力且表面標(biāo)記均符合。
　　2. BMMSCs對(duì)ConA誘發(fā)的小鼠肝臟損傷具有治療作用。
　　3. BMMSCs不能抑制ConA對(duì)脾臟中CD4+T淋巴細(xì)胞的激活。
　　4. BMMSCs通過影響脾臟 CD4＋T淋巴細(xì)胞亞群，一方面降低 Th1、Th2細(xì)胞比例導(dǎo)致其分泌的外周血中相應(yīng)細(xì)胞