他克莫司對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性肌炎小鼠中CD4+T淋巴細(xì)胞亞群的影響.pdf

1、特發(fā)性炎癥性肌病（idiopathic inflammatory myopathies, IIMs）是一組以骨骼肌炎性細(xì)胞浸潤、肌無力、肌疲勞為特征的一組疾病,根據(jù)不同的臨床和病理學(xué)特征，可以分為以下幾類：多發(fā)性肌炎、皮肌炎、包涵體肌炎、壞死性肌炎。免疫細(xì)胞介導(dǎo)的肌纖維損傷、肌炎特異性和肌炎相關(guān)抗體的存在及骨骼肌MHC-Ⅰ分子的過表達(dá)充分說明該疾病是一種免疫介導(dǎo)的疾病。
　　免疫組織化學(xué)研究表明，患者肌肉組織有大量炎性細(xì)胞浸潤，主

2、要為巨噬細(xì)胞和CD8+、CD4+T細(xì)胞。Th1和Th17細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞的亞群，二者在多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種自身免疫性疾病發(fā)生發(fā)展中有關(guān)鍵作用。肌炎患者血清TNF、IFN-γ、IL-12的升高提示Th1介導(dǎo)了該類疾病的發(fā)生。最近研究描述了Th17相關(guān)因子如IL-17、IL-22、IL-6在肌炎患者的過度表達(dá)，突出了Th17在肌炎發(fā)病中的作用。Treg細(xì)胞是具有免疫抑制功能的、CD4+T細(xì)胞的另一個(gè)亞群，是維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)和

3、免疫耐受的重要細(xì)胞。一般情況下，三者處于一種動(dòng)態(tài)平衡。免疫穩(wěn)態(tài)的打破，如Treg功能缺失，Th1、Th17等效應(yīng)T細(xì)胞過度增殖，常導(dǎo)致炎癥和多種自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展。
　　目前IIMs確切病因及致病機(jī)制不明，臨床上多采用糖皮質(zhì)激素的對癥治療，長時(shí)間應(yīng)用副作用大、效果并不理想。他克莫司（tacrolimus, Tac）是從鏈霉菌屬中提取的大環(huán)內(nèi)酯類化合物，是一種鈣調(diào)磷酸酶抑制劑，通過抑制磷酸酶的活化下調(diào)IL-2水平，進(jìn)而抑制T淋

4、巴細(xì)胞的增殖。Tac作為一種新型強(qiáng)效免疫抑制劑，已被應(yīng)用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎癥性腸病等自身免疫性疾病并顯示出良好的治療作用。那么， Tac對IIMs的作用及對肌炎中Th1、Th17、Treg細(xì)胞的影響如何，尚未有明確報(bào)道。本研究擬通過Tac干預(yù)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性肌炎（experimental autoimmune myositis， EAM）小鼠，檢測小鼠中Th1、Th17、Treg細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子的變化，觀察Tac對肌炎小鼠中三種C

5、D4+T細(xì)胞亞群的影響，探討Tac的可能治療作用。
　　目的：
　　觀察Tac對肌炎小鼠Th1細(xì)胞及IFN-γ、Th17細(xì)胞及IL-17A、Treg細(xì)胞及Foxp3的影響，評估Tac對EAM小鼠的治療效果，為IIMs的治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　實(shí)驗(yàn)一 Tac對EAM小鼠的治療作用
　　15只雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為正常對照組、EAM模型組、Tac干預(yù)組。連續(xù)14天藥物干預(yù)后，分別觀察各組小鼠一

6、般狀態(tài)，測量各組小鼠肌力；HE染色觀察三組小鼠肌纖維損傷及炎細(xì)胞浸潤情況；RT-PCR檢測肌肉組織 IL-1β、IL-6、IL-23 mRNA表達(dá)水平；液相芯片技術(shù)檢測三組小鼠血清IL-1β、IL-6水平。
　　實(shí)驗(yàn)二 Tac對EAM小鼠Th1、Th17、Treg細(xì)胞的影響
　　分離小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，按106/ml接種于96孔培養(yǎng)板，分別給予不同濃度Tac干預(yù)，采用CCK8法檢測Tac對脾細(xì)胞增殖的影響；PMA、Ionomy

7、cin刺激脾臟淋巴細(xì)胞活化，F(xiàn)ACS檢測CD4+T細(xì)胞表面CD25、CD69的表達(dá)，觀察不同劑量Tac對CD4+T細(xì)胞活化的影響；FACS檢測三組小鼠脾臟中Th1、Th17、Treg細(xì)胞的數(shù)量；RT-PCR檢測小鼠脾臟IFN-γ、IL-17A、Foxp3 mRNA及IL-12、IL-23 mRNA表達(dá)水平；液相芯片技術(shù)檢測三組小鼠血清IFN-γ、IL-17A水平。
　　結(jié)果：
　　實(shí)驗(yàn)一正常組小鼠肌力較好，時(shí)間都大于1800

8、s，EAM組小鼠肌力大幅度下降，為150.2±17.31s，與EAM組相比，Tac干預(yù)組肌力明顯回升，為245.8±14.02s（P＜0.05）；HE染色可見大量炎細(xì)胞浸潤EAM小鼠肌肉組織，Tac干預(yù)組與EAM組相比，炎細(xì)胞明顯減少；三組小鼠肌肉組織學(xué)評分分別為0、2.38±0.17、1.76±0.15（P＜0.05 EAM組 vs正常組；P＜0.05 Tac組 vs EAM組）；三組小鼠肌肉組織 IL-1β、IL-6、IL-23mR

9、NA表達(dá)情況：與正常組小鼠相比，EAM小鼠肌肉組織IL-1β、IL-6、IL-23 mRNA表達(dá)水平均顯著升高（IL-1β：1.03±0.29 vs3.18±0.41，IL-6：1.01±0.16 vs2.77±0.36，IL-23：1.02±0.23 vs2.85±0.54），三者表達(dá)水平在Tac干預(yù)組小鼠有明顯下降（分別為2.34±0.37、1.99±0.40、1.89±0.34），與EAM組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）

10、；正常組小鼠血清中IL-1β、IL-6水平較低，分別為4.64±1.68pg/ml，17.92±5.61pg/ml，EAM組可見有大幅度升高（IL-1β：34.54±4.10pg/ml，IL-6：170.71±21.93pg/ml），而Tac干預(yù)組二者濃度雖仍然比較高，但相比較EAM組，下降明顯（IL-1β：23.89±5.14pg/ml，IL-6：77.51±14.03pg/ml），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　實(shí)驗(yàn)二

11、 Tac可明顯抑制脾淋巴細(xì)胞增殖，且呈一定的劑量依賴性。Tac可顯著減少CD4+T淋巴表面CD25、CD69表達(dá)：正常組、Tac干預(yù)組（低、中、高劑量組）CD4+T淋巴細(xì)胞CD25表達(dá)率分別為75.56±4.92％，22.83±4.13%，15.77±4.21%，10.63±2.77%；CD69表達(dá)率分別為73.92±4.33%，48.13±3.95%，43.44±2.66%，40.40±3.11%。與正常組相比，EAM組小鼠脾臟Th1

12、、Th17、Treg細(xì)胞顯著增多（Th1：0.97±0.33% vs3.24±1.39%，Th17：0.51±0.09%vs1.47±0.47%，Treg：1.47±0.21%vs3.27±0.90%）， Tac干預(yù)組三者均有不同程度下降（Th1：1.52±0.24%，Th17：0.82±0.07%，Treg：1.87±0.15%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。三組小鼠脾臟IFN-γ、IL-17A、Foxp3 mRNA的變化趨勢與

13、各自的細(xì)胞一致：與正常組相比，EAM組顯著升高，Tac干預(yù)組均有不同程度回落（IFN-γ：1.03±0.28，3.41±0.49，2.34±0.63；IL-17A：1.00±0.09，2.78±0.62，2.04±0.30；Foxp3：1.04±0.24，1.73±0.28，1.19±0.24）。正常組小鼠血清IFN-γ較低，為2.14±0.55pg/ml，EAM組小鼠該因子水平較正常組增長了10倍之多（23.56±5.22pg/ml）

14、，Tac干預(yù)組可見顯著下降（16.10±3.16pg/ml）。血清 IL-17A變化趨勢同IFN-γ，EAM組最高，約為正常組的9倍，Tac組較EAM組明顯下降（三組濃度分別為：10.77±4.27pg/ml，91.97±27.52pg/ml，43.37±16.81pg/ml）。與正常組相比，模型組小鼠脾臟 IL-12、IL-23mRNA水平顯著升高（ IL-12：0.96±0.09 vs3.01±0.82，IL-23：1.06±0.1

15、9 vs2.10±0.42），Tac干預(yù)后，二者均明顯下調(diào)（分別為1.67±0.49，1.50±0.19），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1．Tac可改善肌炎小鼠肌力，減輕肌肉組織炎癥。Tac干預(yù)后，肌炎小鼠肌肉組織炎性因子IL-1β、IL-6、IL-23 mRNA表達(dá)水平明顯降低，血清IL-1β、IL-6水平也明顯降低，提示Tac對EAM小鼠有明顯的治療效果。
　　2．Tac對脾臟淋巴細(xì)胞增殖具