小鼠GITR的表達及其對實驗性自身免疫性甲狀腺炎干預(yù)的研究.pdf

1、目的:
　　為了探討糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體相關(guān)蛋白(glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor-relatedprotein，GITR)在免疫相關(guān)性疾病發(fā)生發(fā)展中的作用，尋找可能的免疫干預(yù)途徑。本文克隆了小鼠GITR(mGITR)全長;構(gòu)建了帶有小鼠IgGFc(mIgGFc)的mGITR胞外段（mGITR胞外段-mIgGFc）及單獨mGITR胞外段的兩種原核

2、表達質(zhì)粒，并進行相關(guān)融合蛋白(mGITR及mGITR-Fc)的表達和純化;檢測了兩種融合蛋白的體外生物學(xué)活性;觀察mGITR-Fc融合蛋白對小鼠實驗性自身免疫性甲狀腺炎的影響并分析其可能機制。旨在為GITR的應(yīng)用研究奠定理論依據(jù)和試驗基礎(chǔ)。
　　方法:
　　(1)通過RT-PCR法從小鼠脾臟細胞中擴增獲得mGITR基因全長，克隆至pMD18-T載體后，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α宿主菌，挑取菌落驗證并取陽性菌落進行測序分析。利

3、用網(wǎng)絡(luò)平臺和生物信息學(xué)軟件，對mGITR蛋白氨基酸序列進行生物信息學(xué)分析。
　　(2)應(yīng)用PCR法擴增出帶有合適酶切位點的mGITR胞外段基因和mIgGFc段基因，將其分別克隆至pMD18-T載體后進行測序分析;再經(jīng)酶切和連接，分別將mGITR胞外段基因單獨或與mIgGFc段基因聯(lián)合轉(zhuǎn)移至pET32a(+)原核表達載體。
　　(3)將帶有目的基因的兩種原核表達載體分別轉(zhuǎn)化E.coli Rosetta宿主菌，獲得兩種帶有His

4、的原核蛋白，并分別用鎳柱進行純化，然后經(jīng)Western Blot鑒定。
　　(4)采用MACS磁珠分選技術(shù)，分離純化小鼠脾臟CD4+T細胞，將CD4+T細胞接種96孔細胞培養(yǎng)板進行培養(yǎng)，在每孔中加入相同濃度的mGITRL和不同濃度的mGITR或mGITR-Fc融合蛋白，3H-TdR摻入法檢測mGITR胞外段或mGITR胞外段-Fc融合蛋白對mGITRL刺激CD4+T細胞增殖的影響。應(yīng)用mGITR-Fc融合蛋白作用樹突狀細胞，觀察該

5、蛋白對樹突狀細胞表面GITRL分子表達的影響。
　　(5)構(gòu)建小鼠實驗性自身免疫性甲狀腺炎模型。利用mGITR-Fc融合蛋白干預(yù)該模型后，通過HE染色、流式細胞術(shù)等方法檢測其干預(yù)效果。
　　結(jié)果:
　　(1)成功獲得載有小鼠GITR全長基因的重組載體并經(jīng)測序正確，命名為pMD18-T-mGITR。生物信息學(xué)分析顯示小鼠GITR蛋白胞外區(qū)具有較高的可及性，柔韌性及親水性等，GITR蛋白胞外區(qū)的這些特性為進一步表達該蛋白，

6、以及研究其功能奠定了基礎(chǔ)。
　　(2)成功獲得攜帶mGITR胞外段或mGITR胞外段-mIgGFc基因片段的表達載體，經(jīng)測序驗證，分別命名為pET32a-mGITR胞外段和pET32a-mGITR胞外段-mIgGFc。
　　(3)經(jīng)原核表達并進行蛋白純化，獲得帶有His標(biāo)簽的mGITR胞外段和mGITR胞外段-Fc重組蛋白，并經(jīng)SDS及Westem Blot鑒定。
　　(4)可溶性mGITR和mGITR-Fc融合蛋白，

7、能夠通過與mGITRL的結(jié)合，阻斷其作用于CD4+T細胞表面的GITR，從而抑制mGITRL刺激的CD4+T細胞增殖，其抑制作用呈濃度依賴性。此外，體外實驗還表明，應(yīng)用mGITR-Fc融合蛋白體外作用樹突狀細胞，可見樹突狀細胞表面GITRL分子表達下調(diào)。
　　(5)成功建立了小鼠實驗性自身免疫性甲狀腺炎模型。應(yīng)用這一動物模型的實驗表明，本研究制備的mGITR-Fc融合蛋白能夠延緩實驗性自身免疫性甲狀腺炎的進一步發(fā)展，表現(xiàn)為蛋白干預(yù)

8、后可見病變組織中炎性細胞浸潤減少、血清中mTgAb水平明顯下降等。
　　結(jié)論:
　　成功克隆了小鼠GITR全長及其胞外段基因;構(gòu)建了pET32a-mGITR胞外段、pET32a-mGITR胞外段-mIgGFc兩種表達載體;經(jīng)原核表達成功獲得mGITR和mGITR-Fc融合蛋白。原核表達的mGITR和mGITR-Fc融合蛋白能夠阻斷mGITRL刺激CD4+T細胞而使其增殖降低，該作用與GITR/GITRL共刺激信號相關(guān);mGI