雌激素受體α和β活化對實驗性自身免疫性甲狀腺炎發(fā)生、發(fā)展的影響研究.pdf

1、背景
　　 自身免疫甲狀腺炎(auto immune thyroiditis,AIT)是最常見的自身免疫性甲狀腺病,近年來發(fā)病率明顯增加。AIT患者體內存在高滴度抗甲狀腺過氧化物酶(TP0)和甲狀腺球蛋白(Tg)抗體,甲狀腺內有明顯淋巴細胞浸潤,可導致甲狀腺功能減退。既往研究認為AIT可能是由于中樞免疫耐受被破壞、天然調節(jié)性T細胞(Regulatory T lynmphocytes,Treg)發(fā)育和功能缺陷及樹突狀細胞(DCs)

2、和甲狀腺濾泡上皮細胞(thyroid epithelial cells,TECs)異常的抗原遞呈作用,導致甲狀腺特異輔助性T細胞1(Helper T cell1,Th1)持續(xù)活化、增殖所致。目前認為AIT可能并非僅由經典Th1/Th2免疫反應所致,有其他免疫反應[如分泌白細胞介素17的輔助性T細胞(Interleukin-17secreting helper T cells,Th17)]存在。然而AIT的發(fā)病機制復雜,尚未完全闡明。AI

3、T的臨床特點及一些初步研究提示雌激素在AIT發(fā)病有重要影響:女性發(fā)病率為男性的3-4倍,高發(fā)年齡在30-50歲;該病常在妊娠時自發(fā)緩解而于分娩后惡化,且青春期發(fā)育是促進具有遺傳背景的女性發(fā)病的重要因素。近年來發(fā)現雌激素受體(estrogen receptor,ER)有ERα和ERβ2種亞型,其各自介導的對靶器官的影響目前在國際上倍受關注,已發(fā)現有些情況下二者活化后產生的效應類似“陰陽”平衡。目前最常用的ERα選擇性激動劑是化合物prop

4、yl-pyrazole-triol(PPT),β亞型選擇性激動劑為diarylpropionitrile(DPN)。亞型選擇性ER激動劑現為國外多家藥物研究機構研發(fā)重點,可能給雌激素敏感性疾病提供新的防治手段。關于雌激素對AIT發(fā)病有何影響仍不清楚,缺乏直接干預一效應研究,而二種ER亞型各自被激活后所介導的對該病的作用更是未見報道。
　　 目的
　　 以Tg免疫易感株小鼠建立的EAT模型為研究對象,利用亞型選擇性ER激動

5、劑,直接探討ERα和ERβ被各自單獨活化對AIT發(fā)病的影響,并主要從免疫耐受、抗原遞呈和Th極化與應答角度,探討了ER活化介導的調節(jié)作用機制。
　　 方法
　　 4周齡CBA/J雌性小鼠在中國醫(yī)科大學實驗動物中心無特定病原體(Specefic pathogen Free,SPF)級環(huán)境下飼養(yǎng)。6周齡時進行雙側卵巢切除(OVX),之后按美國Harlan Teklad公司提供的配方(Rodent Diet2016)生產的不含

6、植物雌激素的飼料喂養(yǎng),隨機分為5組。分組如下:
　　 OVX對照組:OVX+DMSO/玉米油,皮下注射,每4天1次直至動物被處死。
　　 PPT1組:OVX+PPT(2.0mg/kg體重)皮下注射同上。
　　 PPT2組:OVX+PPT(20.0mg/kg體重)皮下注射同上。
　　 DPN1組:OVX+DPN(1.2mg/kg體重)皮下注射同上。
　　 DPN2組:OVX+DPN(12.0mg/k

7、g體重)皮下注射同上。
　　 于9周齡時給予mTg(200μg/只)加完全弗氏佐劑進行初次免疫,11周齡時重復免疫一次(mTg加不完全弗氏佐劑),15周齡時處死動物。
　　 取甲狀腺組織做石蠟切片HE染色觀察淋巴細胞浸潤情況并進行甲狀腺炎癥程度評分;留取血清利用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定Tg抗體(TgAb)滴度,包括Tg特異性總IgG和各IgG亞類;化學發(fā)光法檢測小鼠總甲狀腺素(Total thyroxine,T

8、T4)及促甲狀腺激素(Thyroid Stimulating Hormone,TSH);取脾制成單個核細胞懸液,免疫熒光染色、流式細胞學檢測Tregs、Th17及DCs抗原遞呈細胞比例的變化;提取小鼠脾細胞總RNA,實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應法(Quantitative Real-Time Reverse Transcripte Polymerase Chain Reaction,real-timeRT-PCR)檢測細胞因子:γ干擾素(

9、Interferon-γ,IFN-γ,Th1型細胞因子)、白細胞介素-4(Interleukin-17,IL-4,Th2型因子)、白細胞介素-17(Interleukin-17,IL-17,Th17型因子)、白細胞介素-21(Interleukin-21,IL-21,Th17型因子)、轉化生長因子-β(transforminggrowthfactorβ,TGF-β,抑制性細胞因子)以及Th1、Th2、Th17及Tregs特異性轉錄因子:

10、叉頭蛋白P3(forkheadboxP3,Foxp3)、T-盒21轉錄因子(T-box21transcriptionfactor,T-bet)、GATA結合蛋白3(GATA binding protein3,GATA3)、視黃酸受體相關孤兒受體γt(Retinoic acid receptor-related orphan receptorγt,RORγt)的信使核糖核酸(Messenger ribouncleic acid,mRNA)

11、的表達水平。應用SPSS16.0軟件處理和分析數據。
　　 結果
　　 1、給予ERβ選擇性激動劑DPN可導致EAT發(fā)病率、甲狀腺炎癥細胞浸潤程度加重。而給予ERα選擇性激動劑PPT后EAT發(fā)病率、甲狀腺炎癥評分與OVX對照組無明顯差異。
　　 2、給予ERβ選擇性激動劑注射的DPN1組血清Tg特異性IgG1、IgG2b滴度較OVX對照組有升高趨勢,DPN2組血清Tg特異性IgG1、IgG2a、IgG2b滴度顯著

12、升高,IgG3也有升高趨勢。給予ERQ選擇性激動劑注射的PPT組血清TgAb(IgG各亞類)滴度與OVX對照組比較無明顯差異。
　　 3、與OVX對照組比較,PPT組的血清TSH無明顯改變,DPN組的血清TSH有升高的趨勢(DPN1:P=0.095,DPN2:P=0.092)。血清TT4各組間無明顯變化。
　　 4、與OVX對照組相比,DPN1組小鼠脾細胞DC(CD11c+細胞)表面表達協(xié)同刺激因子CD86者(CD11c

13、+CD86+)明顯升高,DPN2組表達CD80(CD11c+CD80+)、CD86(CD11c+CD86+)者明顯升高。PPT1組和PPT2組小鼠脾細胞DC中CD80、CD86表達比例無顯著變化。DC中產生細胞因子IL-6、IL-12者均無明顯差異。
　　 5、除DPN2組小鼠脾細胞中T-betmRNA表達量高于OVX對照組外,各組IFN-γ、IL-4、GATA3mRNA表達量與OVX對照組相比無明顯變化。
　　 6、D

14、PN組的小鼠脾細胞中RORγt、IL-17A、IL-21mRNA表達量增多,Th17細胞比例升高,以DPN2組最為顯著。PPT2組小鼠脾臟CD4+T細胞中Treg(CD4+CD25+FOXP3+細胞)比例及Foxp3、TGF-βmRNA表達水平明顯增多,DPN組未見減少,但各組Treg表面功能抑制分子GITR的表達水平均有上升,以PPT2組和DPN2組最為明顯。
　　 結論
　　 1、ERβ可能是介導雌激素影響EAT發(fā)生