血脂康對實驗性自身免疫性神經(jīng)炎的治療潛能.pdf

1、目的：
　　格林巴利綜合征（Guillain-Barré syndrome，GBS），又稱急性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病，是常見的脊神經(jīng)和周圍神經(jīng)的脫髓鞘疾病，是一種神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病，其發(fā)病機制為分子模擬理論，即外源性感染因子上存在與正常組織成分結構相同或相近的共同抗原表位，抗感染免疫去除感染因子的同時產(chǎn)生自身抗體，損害神經(jīng)組織。實驗性自身免疫性神經(jīng)炎(Experimental autoimmuneneuritis，EAN)

2、是一種主要由CD4+T細胞介導的，累及外周神經(jīng)系統(tǒng)(peripheralnervous system，PNS)的急性炎癥性脫髓鞘性疾病，其在發(fā)病機制、臨床表現(xiàn)、神經(jīng)病理學改變及電生理等諸多方面，同人類GBS極為相似，因此已被國際上公認為研究GBS的理想動物模型。應用周圍神經(jīng)髓鞘蛋白或其組成成分P2或P0蛋白或其肽與完全弗氏佐劑共同免疫敏感動物可成功誘導EAN模型。體液免疫和細胞免疫均參與其發(fā)病機制。
　　血脂康膠囊是由特制紅曲發(fā)酵

3、而成，含13種天然莫納可林(Monacolin)，為他汀同系物，發(fā)揮調脂作用。其主要成分為洛伐他汀，還含有多種不飽和脂肪酸以及必需氨基酸，但其對HMG-CoA還原酶活性的抑制優(yōu)于洛伐他汀。他汀類藥物是3-羥基-3甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶的抑制劑，通過阻斷甲羥戊酸途徑抑制膽固醇的合成，臨床上主要用于降低低密度脂蛋白。目前越來越多的研究集中于他汀類藥物與自身免疫病間的關系，如多發(fā)性硬化和類風濕關節(jié)炎等。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀通過抑

4、制Th1和Th17免疫反應，下調細胞表面共刺激分子表達并上調淋巴結單個核細胞中Treg細胞的比例從而緩解了EAN病情。而阿托伐他汀修飾的樹突狀細胞疫苗可以誘導重癥肌無力大鼠免疫耐受，其機制包括增加了CD4+CD25+Treg的比例及Foxp3的表達、抑制淋巴細胞增生、誘導T細胞分泌的Th1/Th17型細胞因子向Th2型細胞因子轉化以及減弱血清中抗R97-116肽IgG抗體的產(chǎn)生。
　　然而血脂康作為傳統(tǒng)降脂中藥，其所含成分雖含他汀

5、卻又與他汀類藥物不盡相同。本研究通過構造實驗性自身免疫性神經(jīng)炎動物模型，闡明血脂康誘導EAN免疫耐受的機制，為臨床應用血脂康治療GBS提供實驗和理論基礎。
　　方法:
　　1.1.材料
　　1.1.1.實驗動物:雌性Lewis大鼠，6～8周齡，體質量155～185 g。
　　1.1.2.主要試劑:抗原為周圍髓鞘蛋白(P0)抗原180～199肽段。
　　1.2.實驗方法
　　1.2.1.EAN模型的誘導

6、及臨床評分
　　于每只大鼠雙后足墊皮下給予200μL抗原乳液（含200μg P0180-199肽，1.5mg H37Ra結核桿菌，不完全弗氏佐劑），每側100μL，免疫當天記為第0天。采用雙盲評估法，自免疫當天開始每天評測大鼠臨床癥狀并記錄體質量，至免疫后第16天（臨床癥狀達高峰時）。臨床評分標準為0級:正常;1級:尾部無力;2級:輕度后肢癱瘓;3級:中度后肢癱瘓;4級:重度后肢癱瘓5級:四肢癱。以每個時間點的平均數(shù)表示實驗結果。

7、
　　1.2.2.血脂康治療EAN
　　15只大鼠隨機分為對照組、小劑量治療組(200 mg/kg/day)和大劑量治療組(1000 mg/kg/day)。自免疫后第五天開始每天給予血脂康灌胃治療，直至免疫后第16天。對照組給予等體積的0.9％生理鹽水灌胃處理。
　　1.2.3淋巴結單個核細胞懸液的制備
　　免疫后第16天麻醉大鼠，無菌條件下取雙側腹股溝淋巴結制備淋巴結單個核細胞懸液。用完全培養(yǎng)基調整細胞密度為2

8、×106個/mL。
　　1.2.4.胞內細胞因子流式檢測
　　取淋巴結單個核細胞懸液，分別加入PE標記的抗大鼠IL-10和TNF-α及FITC標記的IL-17A和IFN-γ抗體，避光，于4℃環(huán)境下孵育30 min后重懸上機檢測。
　　1.2.5.流式檢測Treg細胞情況
　　取淋巴結單個核細胞懸液，加入FITC標記的CD4抗體和PE標記的CD25抗體，4℃下孵育30 min。洗滌后加入固定/破膜工作液并混勻，4℃

9、下避光孵育過夜。洗滌細胞后加入PE-Cy5標記的Foxp3抗體，4℃孵育30 min。細胞重懸過濾后上機檢測。
　　1.3.統(tǒng)計學處理
　　采用spss22.0統(tǒng)計軟件分析，結果以均數(shù)±標準差表示，應用單因素方差分析(one-factor analysis of variance，ANOVA)比較3組標本的組間差異，p＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1.血脂康治療組臨床評分降低
　　2.血脂