脫氫表雄酮對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性神經(jīng)炎保護(hù)作用的研究.pdf

1、研究目的: 格林-巴利綜合征（Guillain-Barré syndrome，GBS）是引起遲緩性麻痹的主要疾病，是外周神經(jīng)的炎癥性脫髓鞘疾病。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性神經(jīng)炎（experimental autoimmune neuritis，EAN）是CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的外周神經(jīng)自身免疫性脫髓鞘疾病，其臨床經(jīng)過、神經(jīng)電生理檢查及病理學(xué)改變與GBS最常見的臨床亞型一急性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)神經(jīng)炎（acute inflammation dem

2、yelinative polyradiculoneuropathy，AIDP）極為相似，是公認(rèn)的研究GBS的經(jīng)典動(dòng)物模型。目前，GBS的治療主要是血漿置換或靜脈注射丙種球蛋白，雖然其能縮短病程，加快病情恢復(fù)，但仍有大約5％病死率，20％的患者遺留永久性殘疾。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，糖皮質(zhì)激素等免疫抑制劑的對(duì)本病無效。因此，有必要探討治療GBS的新方法。 脫氫表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA）是一種19碳類固醇

3、，是雌激素和雄激素的前體物質(zhì)，也是目前尚不明確的多種免疫調(diào)節(jié)性類固醇的前體物質(zhì)。體內(nèi)、外研究證實(shí)DHEA及其代謝產(chǎn)物具有抗炎、抗增殖和免疫調(diào)節(jié)活性，對(duì)人和動(dòng)物的免疫系統(tǒng)可產(chǎn)生有益的作用。EAN是Th1細(xì)胞介導(dǎo)的外周神經(jīng)自身免疫性脫髓鞘疾病，神經(jīng)內(nèi)膜下T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)及多灶性、節(jié)段性髓鞘脫失為主要病理改變，促炎性細(xì)胞因子（如IFN-γ、TNF-α、IL-12、NO等）在其發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵作用。目前國(guó)內(nèi)外尚未見有應(yīng)用DHEA治療EA

4、N的報(bào)道，基于以往體內(nèi)外研究證實(shí)的DHEA對(duì)免疫系統(tǒng)的作用，我們應(yīng)用DHEA治療發(fā)病初期EAN，通過觀察EAN的臨床、病理及免疫指標(biāo)，評(píng)價(jià)DHEA對(duì)發(fā)病初期EAN的治療作用并探討其免疫保護(hù)機(jī)制。 方法: 1.抗原：采用超速離心法自牛脊神經(jīng)根提取周圍神經(jīng)髓磷脂（bovine peripheral nerve myelin， BPM）。 2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：6-8周齡雌性Lewis大鼠36只，體重150-170g，SPF級(jí)

5、飼養(yǎng)。 3.EAN模型的建立及臨床評(píng)分：大鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)一周，氯胺酮（10mg/Kg）麻醉。將100μl抗原乳劑（含BPM5mg、結(jié)核桿菌1mg、不完全弗氏佐劑50μl、生理鹽水50μl）注入雙側(cè)后肢足墊皮下。于免疫前即時(shí)及免疫后每日進(jìn)行臨床評(píng)估，直至免疫后28天。臨床評(píng)分：0：正常；0.5：全尾肌張力下降；1.0：尾部肌肉癱，松軟拖地；1.5：輕微后肢無力，肌張力下降；2.0：明顯后肢無力或輕度后肢癱；2.5：中度后肢癱；3.

6、0：嚴(yán)重后肢癱；4：嚴(yán)重四肢癱。 4.脫氫表雄酮（DHEA）治療：將大鼠隨機(jī)分為DHEA0.5mg/劑治療組、2mg/劑治療組和對(duì)照組，每組各12只。治療組于免疫后第5天開始皮下注射DHEA，體積50μl，每日一次，至免疫后28天。對(duì)照組皮下注射相同體積的DHEA溶媒二甲基亞砜（DMSO）。 5.組織病理學(xué)檢查：于免疫后16天處死大鼠，每組各7只，取坐骨神經(jīng)近脊髓段，10％福爾馬林固定，石蠟包埋，縱行切片（5-6μm，每

7、根神經(jīng)2張連續(xù)切片），HE染色，應(yīng)用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)40倍物鏡下采集圖像，每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)坐骨神經(jīng)中浸潤(rùn)的單個(gè)核細(xì)胞，取其平均值，結(jié)果以細(xì)胞數(shù)/m㎡組織表示。 6.免疫組化檢測(cè)：大鼠坐骨神經(jīng)石蠟切片，常規(guī)脫蠟致水，經(jīng)阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性、抗原修復(fù)、牛血清白蛋白封閉處理，分別滴加一抗（山羊抗大鼠IFN-γ、TNF-α多克隆抗體）和二抗（辣根過氧化酶標(biāo)記兔抗山羊IgG），DAB顯色，蘇木蘇復(fù)染，脫水，透明，封固。4

8、0倍物鏡下采集圖像，觀察大鼠坐骨神經(jīng)中細(xì)胞陽(yáng)性反應(yīng)，結(jié)果以細(xì)胞數(shù)/m㎡組織表示。 7.單個(gè)核細(xì)胞體外增殖試驗(yàn)：取免疫后16天EAN大鼠腹股溝淋巴結(jié)和脾臟制備單個(gè)細(xì)胞懸液（2×106/ml），懸浮于RPMI1640培養(yǎng)基，接種到96孔培養(yǎng)板，分別加入10μl BPM、植物血凝素（phytohemagglutinin，PHA）和磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution，PBS）培養(yǎng)48小時(shí)，再加入3H-

9、甲基胸腺嘧啶脫氧核苷1μCi/孔，18小時(shí)后收集細(xì)胞，β-液體閃爍儀檢測(cè)測(cè)定胸腺嘧啶核苷結(jié)合量，結(jié)果以每分鐘放射性熒光閃爍計(jì)數(shù)值（cpm）表示。 8.單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子檢測(cè)：來自引流淋巴結(jié)和脾臟的單個(gè)核細(xì)胞懸液（2×106/ml），加入BPM（終濃度20μg/ml），培養(yǎng)48小時(shí)，收獲上清液。應(yīng)用酶聯(lián)免疫分析試劑盒檢測(cè)TNF-α、IFN-γ、IL-10，操作按說明書步驟進(jìn)行。標(biāo)準(zhǔn)品和樣本均設(shè)雙復(fù)孔，結(jié)果以pg/ml表示

10、。 9.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS13.0軟件對(duì)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以x±s表示。應(yīng)用單因素方差分析或秩和檢驗(yàn)（Kruskal-Wallis檢驗(yàn)法）進(jìn)行組間比較，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義則用SNK法或Bonferroni法進(jìn)行組間兩兩比較，P<0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果: 1.DHEA延遲EAN發(fā)病時(shí)間：三組大鼠在發(fā)病時(shí)間上表現(xiàn)出明顯差異，DHEA2mg治療組發(fā)病時(shí)間為11.83±0.94天，0.5mg治療組

11、為10.92±1.08天，對(duì)照組為9.17±0.94天。與對(duì)照組比較，兩種劑量DHEA治療組發(fā)病時(shí)間均延遲（P<0.05，P<0.05），DHEA2mg治療組與0.5mg治療組比較發(fā)病時(shí)間亦明顯延遲（P<0.05）。 2.DHEA降低EAN高峰期臨床評(píng)分：疾病高峰期（免疫后第16d）臨床評(píng)分顯示DHEA2mg治療組為1.42±0.73，0.5mg治療組為2.00±0.56，對(duì)照組為2.29±0.62。與對(duì)照組比較，DHEA2mg

12、治療組疾病高峰期臨床評(píng)分明顯降低（P<0.05）。DHEA2mg治療組疾病高峰期臨床評(píng)分明顯低于0.5mg治療組（P<0.05）。0.5mg治療組疾病高峰期評(píng)分低于對(duì)照組，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理無顯著差異。 3.DHEA減少炎性細(xì)胞在外周神經(jīng)浸潤(rùn)：疾病高峰期大鼠坐骨神經(jīng)組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示， DHEA2mg治療組骨神經(jīng)中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)目為37.00±29.59個(gè)/m㎡組織，0.5mg治療組為62.00±37.11/m㎡組織，對(duì)照組為1

13、05.50±31.05/m㎡組織。與對(duì)照組比較，DHEA2mg治療組和0.5mg治療組坐骨神經(jīng)中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)目均明顯減少（P<0.05，P<0.05）。DHEA2mg治療組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)目較0.5mg治療組減少，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理無意義。 4.DHEA抑制脾臟單個(gè)核細(xì)胞增殖反應(yīng)：于EAN高峰期高峰期檢測(cè)大鼠引流淋巴結(jié)和脾臟單個(gè)核細(xì)胞體外增殖， BPM、PHA誘導(dǎo)的和無抗原刺激（PBS）組單個(gè)核細(xì)胞增殖（cpm）分別為：DHEA2m

14、g治療組2900±672、4500±1581和594±220；0.5mg治療組5125±1433、6562±1720和1150±160；對(duì)照組9125±1941、11680±2344和1338±358。結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較兩種劑量DHEA治療組均能明顯抑制BPM和PHA誘導(dǎo)的單個(gè)核細(xì)胞增殖（P<0.05，P<0.05，P<0.05，P<0.05）；與對(duì)照組比較，DHEA2mg治療組對(duì)無抗原刺激組（PBS）單個(gè)核細(xì)胞增殖有明顯抑制作用（

15、P<0.05），0.5mg治療組與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 5.DHEA減少外周神經(jīng)促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生：應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)疾病高峰期大鼠坐骨神經(jīng)中IFN-γ、TNF-α表達(dá)，結(jié)果顯示IFN-γ、TNF-α陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞數(shù)分別為：DHEA2mg治療組17.50±13.03個(gè)/m㎡組織、13.63±10.03個(gè)/m㎡組織，0.5mg治療組25.75±13.78個(gè)/m㎡組織、20.50±11.41個(gè)/m㎡組織，對(duì)照組64.88±23

16、.22個(gè)/m㎡組織、47.00±16.63個(gè)/m㎡組織。 6.DHEA影響單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清液細(xì)胞因子水平：應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)引流淋巴結(jié)和脾臟單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、TNF-α、IL-10水平。 結(jié)論: 1.應(yīng)用兩種劑量脫氫表雄酮（DHEA）治療發(fā)病初期EAN，與對(duì)照組比較，可明顯延緩發(fā)病時(shí)間，降低疾病高峰期臨床評(píng)分，減少坐骨神經(jīng)中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)目，提示DHEA對(duì)外周神經(jīng)自身免疫性疾病有治療作用。

17、 2.應(yīng)用兩種劑量DHEA治療發(fā)病初期EAN，與對(duì)照組比較，可明顯抑制BPM誘導(dǎo)的單個(gè)核細(xì)胞增殖，減少坐骨神經(jīng)中IFN-γ、TNF-α陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞數(shù)目，降低BPM刺激的單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、TNF-α水平。提示DHEA可抑制EAN大鼠自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞增殖和促炎性細(xì)胞因子過度表達(dá)，抑制細(xì)胞免疫反應(yīng)。 3.DHEA可降低全身和病灶局部IFN-γ、TNF-α水平，對(duì)IL-10產(chǎn)生無影響。表明DHEA對(duì)EAN的治療作用