特立氟胺聯(lián)合白芍總苷對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓膜炎小鼠神經(jīng)保護(hù)作用研究.pdf

1、目的：本實(shí)驗(yàn)研究了特立氟胺（teriflunomide，TIF）聯(lián)合白芍總苷（total glucosides of paeony， TGP）對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE）小鼠，多發(fā)性硬化（multiple sclerosis, MS）的動(dòng)物模型的保護(hù)作用。通過(guò)對(duì)EAE小鼠行為學(xué)觀察以及對(duì)脊髓腰膨大進(jìn)行HE染色，LFB染色以及電鏡觀察，探索特立氟

2、胺與白芍總苷聯(lián)用對(duì)EAE小鼠的治療作用，為聯(lián)合用藥治療多發(fā)性硬化提供新思路。
　　方法：
　　1選用50只8-10周齡的、健康的、雌性、體重約為18g-20g的C57BL/6小鼠。將其隨機(jī)分為5組：Control組、EAE組、特立氟胺組、白芍總苷組及特立氟胺與白芍總苷聯(lián)合用藥組，每組小鼠10只。EAE組、特立氟胺組、白芍總苷組及特立氟胺加白芍總苷組使用 MOG35-55合成多肽作為抗原，以結(jié)核菌素、完全弗氏佐劑及百日咳毒素為

3、輔劑，建立小鼠 EAE模型，Control組不予免疫。免疫當(dāng)天記為第0天，自免疫第1天開(kāi)始給予藥物治療，即特立氟胺組15mg/kg TIF，白芍總苷組500mg/kg TGP，聯(lián)合用藥組特立氟胺、白芍總苷分別為15mg/kg、500mg/kg，正常對(duì)照組和EAE組小鼠每日灌服等體積的1.5％的羧甲基纖維素鈉。從免疫第1天起，采用雙盲法每日早晚（8:00和16:00）各一次，由兩名不同觀察者分別對(duì)小鼠進(jìn)行稱重，同時(shí)進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分直到處死

4、。神經(jīng)功能評(píng)分采用Weaver（15分）法，觀察并記錄小鼠發(fā)病情況及病程。
　　2選用40只8-10周齡的、健康的、雌性、體重約為18g-20g的C57BL/6小鼠。將其隨機(jī)分為5組：Control組、EAE組、特立氟胺組、白芍總苷組及特立氟胺加白芍總苷組，每組小鼠8只。EAE組、特立氟胺組、白芍總苷組及特立氟胺加白芍總苷組使用 MOG35-55合成多肽作為抗原，以結(jié)核菌素、完全弗氏佐劑及百日咳毒素為輔劑，建立小鼠 EAE模型，

5、Control組不予免疫。免疫當(dāng)天記為第0天，自免疫第1天開(kāi)始開(kāi)始藥物治療，即特立氟胺組15mg/kg，白芍總苷組500mg/kg，聯(lián)合用藥組特立氟胺、白芍總苷分別為15mg/kg、500mg/kg，正常對(duì)照組和EAE組小鼠每日灌服等體積1.5%的羧甲基纖維素鈉。各組小鼠分別于26天取材每組5只。取小鼠脊髓，固定，取脊髓腰膨大處組織進(jìn)行石蠟包埋，分別通過(guò)HE染色觀察脊髓病變部位炎性浸潤(rùn)程度，羅克沙爾堅(jiān)牢藍(lán)（Luxol Fast Blue

6、, LFB）特殊髓鞘染色觀察髓鞘脫失情況；另每組各取3只做灌注以備電鏡觀察。通過(guò)上述方法觀察各藥物及藥物之間的聯(lián)合對(duì)于小鼠病變部位炎癥細(xì)胞及髓鞘脫失情況。應(yīng)用 SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果如為計(jì)量資料則用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）表示；若滿足正態(tài)分布，多組計(jì)量資料均數(shù)的比較則采用 ANOVA方差分析；若不滿足正態(tài)分布或方差齊性，則采用秩和檢驗(yàn)的方法，P<0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1 Contro

7、l組小鼠不發(fā)?。黄渌鹘M發(fā)病率分別為：EAE組100%，TIF組90%，TGP組80%，聯(lián)合用藥組30%。各組小鼠發(fā)病時(shí)間比較：TGP+TIF組、TGP組、TIF組與EAE組小鼠相比，發(fā)病時(shí)間晚（P<0.05）。TGP+TIF組比 TIF或 TGP單獨(dú)用藥組發(fā)病晚，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。但TGP組與TIF組之間發(fā)病時(shí)間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　2 HE染色：正常對(duì)照組脊髓切面結(jié)構(gòu)清晰，未見(jiàn)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；T

8、GP+TIF組、TGP組、TIF組及EAE組均出現(xiàn)不同程度的髓鞘脫失。其中EAE組最明顯，在脊髓灰白質(zhì)交界處、白質(zhì)、灰質(zhì)、脊髓膜及中央管附近均有不同程度炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，并可見(jiàn)明顯的“血管袖套”現(xiàn)象。與EAE組比，用藥組小鼠脊髓組織中的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)明顯減輕，炎性細(xì)胞主要集中于小血管周圍，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；TGP+TIF組比TIF或 TGP單獨(dú)組小鼠脊髓組織中的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)明顯減少，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。但TGP組

9、與TIF組之間小鼠脊髓組織中的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)無(wú)差異，并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　3 LFB染色：正常對(duì)照組脊髓切面無(wú)明顯髓鞘脫失。各用藥組及模型組均存在著不同程度的髓鞘脫失現(xiàn)象，大多數(shù)位于白質(zhì)內(nèi)的炎癥反應(yīng)灶周圍。EAE組小鼠脊髓內(nèi)可見(jiàn)大小不等的片狀髓鞘脫失區(qū)域，病變分散，大多出現(xiàn)在前、后角周圍的白質(zhì)，藍(lán)色的髓鞘染色部位變少，顏色變淺，髓鞘脫失區(qū)域甚至出現(xiàn)了大片狀氣球樣空泡變性；髓鞘脫失部位常伴隨著大片炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，表明髓

10、鞘脫失和炎癥浸潤(rùn)有一定關(guān)系；TGP組與TIF組均可見(jiàn)不同程度髓鞘脫失，大部分位于脊髓前后角周圍內(nèi)白質(zhì)，但比EAE組輕（P<0.05）。聯(lián)合用藥組可見(jiàn)一些部分髓鞘變薄，顏色變淺，存在一些小的髓鞘脫失區(qū)，但沒(méi)有形成大片狀髓鞘脫失區(qū)域，病灶散在成點(diǎn)灶狀。與其他兩組相比，髓鞘脫失帶非常小，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。但TIF與TGP組之間差異不大（P>0.05）。
　　4透射電鏡：正常對(duì)照組小鼠脊髓結(jié)構(gòu)完整。腰膨大部位白質(zhì)髓鞘無(wú)明顯

11、異常。髓鞘呈規(guī)則同心圓形緊密排列。EAE小鼠位于腰膨大部位白質(zhì)稀疏，髓鞘結(jié)構(gòu)松散，可見(jiàn)髓鞘崩解、斷裂、脫失。各用藥組小鼠腰膨大部位白質(zhì)結(jié)構(gòu)比較完整，排列尚成規(guī)則的同心圓狀，未見(jiàn)明顯的髓鞘崩解與脫失；且聯(lián)合用藥組髓鞘脫失相對(duì)較輕。
　　結(jié)論：
　　1特立氟胺聯(lián)合白芍總苷能夠推遲EAE小鼠的發(fā)病時(shí)間，降低小鼠神經(jīng)功能損傷，對(duì)EAE起神經(jīng)保護(hù)作用，且作用優(yōu)于單藥。
　　2特立氟胺聯(lián)合白芍總苷可明顯減輕 EAE小鼠脊髓炎癥細(xì)胞