腺病毒介導(dǎo)CⅡTA突變體基因轉(zhuǎn)移防治實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎的研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎(experimentalautoimmunethyroiditis，EAT)由于與人類(lèi)橋本甲狀腺炎具有相似的病理特征與疾病進(jìn)程，因此常作為研究橋本甲狀腺炎發(fā)病機(jī)理的動(dòng)物模型。EAT是一種T細(xì)胞介導(dǎo)的以甲狀腺上皮細(xì)胞變性、壞死、纖維化并伴有大量單個(gè)核細(xì)胞浸潤(rùn)為病理特征的免疫性炎癥。在甲狀腺組織中，MHC-Ⅱ類(lèi)分子異常表達(dá)，CD4+T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞大量局部浸潤(rùn)、致炎因子分泌增加，導(dǎo)致抗甲狀腺球蛋白自身反應(yīng)性T細(xì)胞的

2、激活是造成正常甲狀腺損傷的主要原因。因此，有可能通過(guò)靶向性抑制CⅡTA的表達(dá)，下調(diào)MHC-Ⅱ類(lèi)分子的表達(dá)及其對(duì)自身抗原肽的遞呈，達(dá)到對(duì)EAT進(jìn)行防治的目的。 有鑒于此，本研究旨在：(1)通過(guò)構(gòu)建CⅡTA突變體的重組腺病毒，觀察其對(duì)MHC-Ⅱ類(lèi)分子組成性和誘導(dǎo)性表達(dá)的抑制作用；(2)研究CⅡTA突變體基因轉(zhuǎn)移在預(yù)防和治療EAT中的效果及其可能機(jī)制。 本研究設(shè)計(jì)了一種小鼠Ⅳ型CⅡTA的突變體，造成其N(xiāo)-端第109-226位氨

3、基酸的缺失突變。用常規(guī)分子生物學(xué)方法和重疊延伸PCR法(OE-PCR)構(gòu)建了該突變體的兩種腺病毒表達(dá)載體(pAdEasy-1系統(tǒng))，即pAd-CMV-CⅡTAm和pAd-pⅣ-CⅡTAm；腺病毒載體經(jīng)HEK293細(xì)胞包裝產(chǎn)生含CⅡTA突變體的重組腺病毒Ad-CMV-CⅡTAm和Ad-pⅣ-CⅡTAm，用氯化銫密度梯度離心法獲得純化的高滴度腺病毒；采用多種方法對(duì)重組腺病毒進(jìn)行了定量檢測(cè)與活性評(píng)價(jià)；并將Ad-CMV-CⅡTAm和Ad-pⅣ-

4、CⅡTAm分別感染SVEC細(xì)胞與J774細(xì)胞，觀察其對(duì)誘導(dǎo)性與組成性MHC-Ⅱ類(lèi)分子表達(dá)的抑制；用純化的豬甲狀腺球蛋白免疫CBA/J小鼠，誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎模型的產(chǎn)生，并分別于免疫后0～2天與14～16天經(jīng)尾靜脈注射重組腺病毒，觀察CⅡTA突變體對(duì)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎的預(yù)防與治療效果及其機(jī)制。 本研究包括三個(gè)部分： 第一部分CⅡTA突變體重組腺病毒載體的構(gòu)建、擴(kuò)增、純化和滴度測(cè)定本部分內(nèi)容中有關(guān)重組腺病毒的

5、構(gòu)建和包裝的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容由本實(shí)驗(yàn)室2005屆碩士研究生管政完成。采用重疊延伸PCR法(OE-PCR)造成CⅡTA基因N端第325-678位堿基的缺失突變，克隆到pIRES上，得到重組質(zhì)粒pIRES-CⅡTAm。構(gòu)建Ad-CMV-CⅡTAm時(shí)，將pIRES-CⅡTAm克隆到pAdTrack穿梭質(zhì)粒上，經(jīng)PmeI線(xiàn)性化后轉(zhuǎn)入BJAdEasy-1感受態(tài)菌中進(jìn)行同源重組，獲得pAd-CMV-CⅡTAm重組腺病毒骨架質(zhì)粒。構(gòu)建Ad-pⅣ-CⅡTAm時(shí)

6、，先構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒pShuttle-pⅣ并將CⅡTAm克隆到其中，得到pShuttle-CⅡTAm-pⅣ，經(jīng)PmeI線(xiàn)性化后轉(zhuǎn)入BJAdEasy-1感受態(tài)菌中進(jìn)行同源重組，獲得pAd-pⅣ-CⅡTAm重組腺病毒骨架質(zhì)粒。將pAd-CMV-CⅡTAm和pAd-pⅣ-CⅡTAm分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，當(dāng)出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變時(shí)收獲培養(yǎng)上清及細(xì)胞反復(fù)凍融后的細(xì)胞裂解液上清，獲得完整的病毒顆粒。 本部分構(gòu)建的重組腺病毒載體為進(jìn)行顯性失活C

7、ⅡTA突變體抑制CⅡTA基因表達(dá)，定量下調(diào)MHC-Ⅱ類(lèi)分子的表達(dá)，以及防治自身免疫性疾病動(dòng)物模型打下了基礎(chǔ)。 通過(guò)半數(shù)組織細(xì)胞病變法(TCID50)、流式細(xì)胞術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定了經(jīng)CsCl雙密度梯度超速離心純化的重組腺病毒的感染活性與實(shí)際病毒顆粒數(shù)。兩組方法之間的差距平均不超過(guò)102倍，且兩組方法內(nèi)之間的結(jié)果具有明顯的可比性，表明了經(jīng)純化的重組腺病毒具有較穩(wěn)定的性質(zhì)。由于測(cè)定感染活性的方法往往缺乏客觀的判斷標(biāo)準(zhǔn)，且耗時(shí)

8、耗力，較易引起誤差，而測(cè)定病毒實(shí)際顆粒數(shù)的方法又不能反映病毒的感染活性，因此我們推薦在測(cè)定病毒滴度時(shí)運(yùn)用多種方法聯(lián)合評(píng)價(jià)。由于我們純化的病毒活性比較高，為了保持后續(xù)實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性，我們使用了實(shí)際病毒顆粒數(shù)作為劑量標(biāo)準(zhǔn)。 第二部分CⅡTA突變體重組腺病毒的表達(dá)調(diào)控和體外功能研究 本部分首先使用小鼠IFN-γ分別對(duì)小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞株SVEC和小鼠巨噬細(xì)胞株J774進(jìn)行刺激，觀察IFN-γ對(duì)MHC-Ⅱ類(lèi)分子表達(dá)的作用。發(fā)現(xiàn)小鼠I

9、FN-γ能夠誘導(dǎo)SVEC細(xì)胞表達(dá)MHC-Ⅱ類(lèi)分子(IAk)，且隨劑量的增大而使其表達(dá)升高；J774細(xì)胞組成性表達(dá)MHCⅡ類(lèi)分子(IAd)，但小鼠IFN-γ對(duì)J774細(xì)胞MHC-Ⅱ類(lèi)分子的表達(dá)有明顯增強(qiáng)作用。分別用重組腺病毒Ad-CMV-CⅡTAm和Ad-pⅣ-CⅡTAm轉(zhuǎn)染SVEC和J774細(xì)胞，同時(shí)以空載病毒Ad-GFP作為對(duì)照，觀察它們對(duì)誘導(dǎo)性與組成性MHC-Ⅱ類(lèi)分子表達(dá)的抑制作用，同時(shí)觀察野生型CⅡTAmRNA(CⅡTAwt)和突

10、變型CⅡTAmRNA(CⅡTAm)表達(dá)的差異。研究發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)體介導(dǎo)Ad-CMV-CⅡTA和Ad-pⅣ-CⅡTAm轉(zhuǎn)染J774細(xì)胞后，表達(dá)MHC-Ⅱ類(lèi)分子的細(xì)胞陽(yáng)性率明顯下降；Ad-CMV-CⅡTA和Ad-pⅣ-CⅡTAm感染SVEC細(xì)胞后，對(duì)IFN-γ刺激作用的敏感性明顯降低，表達(dá)MHC-Ⅱ類(lèi)分子的細(xì)胞陽(yáng)性率顯著降低。上述結(jié)果證實(shí)了重組腺病毒Ad-CMV-CⅡTA和Ad-pⅣ-CⅡTAm能夠有效抑制組成性與誘導(dǎo)性MHC-Ⅱ類(lèi)分子的表達(dá)。

11、實(shí)時(shí)定量RT-PCR同時(shí)檢測(cè)這些細(xì)胞中CⅡTAwt、CⅡTAm的mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)CⅡTAwt的表達(dá)受ⅡFN-γ的明顯誘導(dǎo)或增強(qiáng)，且腺病毒轉(zhuǎn)染對(duì)CⅡTAwtmRNA表達(dá)水平影響不大。這說(shuō)明，CⅡTA突變體抑制MHCⅡ類(lèi)分子的表達(dá)，并不是通過(guò)減少CⅡTAwt的轉(zhuǎn)錄來(lái)實(shí)現(xiàn)的。我們認(rèn)為，可能是野生型CⅡTA與MHCⅡ啟動(dòng)子區(qū)上的穩(wěn)定小體的結(jié)合受到突變型CⅡTA蛋白的強(qiáng)烈競(jìng)爭(zhēng)，從而降低了MHCⅡ類(lèi)分子的轉(zhuǎn)錄活性。Ad-CMV-CⅡTAm感染

12、或轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，CⅡTAmmRNA有較高水平的表達(dá)，而Ad-pⅣ-CⅡTAm感染或轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，CⅡTAmmRNA表達(dá)水平很低，需IFN-γ刺激才能有高水平表達(dá)。這證實(shí)Ad-pⅣ-CⅡTAm中CⅡTAmmRNA的表達(dá)是IFN-γ依賴(lài)性的。 第三部分腺病毒介導(dǎo)CⅡTA突變體基因轉(zhuǎn)移防治實(shí)驗(yàn)性自身免疫性甲狀腺炎的研究 選擇6周齡的CBA/J小鼠，分別于0天和第7天皮下注射100μg純化的豬甲狀腺球蛋白及CFA/IFA，制備實(shí)驗(yàn)性

13、自身免疫性甲狀腺炎動(dòng)物模型。分別于初次免疫后0～2天與14～16天經(jīng)小鼠尾靜脈注射重組腺病毒Ad-CMV-CⅡTAm和Ad-pⅣ-CⅡTAm(單次劑量為5×109Vp/只)作為預(yù)防實(shí)驗(yàn)組與治療實(shí)驗(yàn)組，并同時(shí)以空載病毒Ad-GFP作為其各自的對(duì)照組，再設(shè)立單純免疫組與正常組對(duì)照。小鼠于初次免疫后第28天眼球取血后，脫頸處死，解剖獲取甲狀腺與脾臟。甲狀腺病理檢查判斷甲狀腺病損程度，測(cè)定小鼠血漿抗甲狀腺球蛋白抗體的滴度與總IgG的量判斷小鼠的

14、體液免疫功能，測(cè)定小鼠脾臟單個(gè)核細(xì)胞對(duì)ConA和甲狀腺球蛋白刺激的增殖能力及細(xì)胞因子的分泌能力反映小鼠細(xì)胞免疫功能，免疫組化測(cè)定小鼠甲狀腺組織中浸潤(rùn)單個(gè)核細(xì)胞與甲狀腺組織中MHC-Ⅱ類(lèi)分子的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定脾及外周血的淋巴細(xì)胞亞群與MHC-Ⅱ類(lèi)分子、ICOS的表達(dá)。 結(jié)果顯示：在預(yù)防性實(shí)驗(yàn)組，以Ad-CMV-CⅡTAm處理的小鼠甲狀腺病損程度明顯減輕，誘導(dǎo)表達(dá)的MHC-Ⅱ類(lèi)分子明顯受抑，自身抗體與總IgG水平均明顯下降，脾單

15、個(gè)核細(xì)胞對(duì)甲狀腺球蛋白的刺激明顯受抑，外周血與脾臟中活化T細(xì)胞上的MHC-Ⅱ類(lèi)分子的表達(dá)及活化T細(xì)胞數(shù)均明顯減少，細(xì)胞因子IFN-γ和IL-2降低。這表明早期使用重組腺病毒Ad-CMV-CⅡTAm能夠有效防止自身免疫性甲狀腺炎的發(fā)生。在治療性實(shí)驗(yàn)組，以Ad-CMV-CⅡTAm處理的小鼠表現(xiàn)出甲狀腺病損程度減輕、脾單個(gè)核細(xì)胞對(duì)甲狀腺球蛋白刺激的應(yīng)答明顯受抑，自身抗體的滴度明顯下降，活化T細(xì)胞上的MHC-Ⅱ類(lèi)分子的表達(dá)量及活化T細(xì)胞數(shù)均明顯

16、減少，但甲狀腺濾泡細(xì)胞上仍有一定水平的MHC-Ⅱ類(lèi)分子的表達(dá)。這些結(jié)果表明發(fā)病后應(yīng)用Ad-CMV-CⅡTAm治療能夠明顯減輕甲狀腺炎的病損程度，對(duì)甲狀腺炎具有一定的治療效果。 以Ad-pⅣ-CⅡTAm代替Ad-CMV-CⅡTAm進(jìn)行預(yù)防或治療EAT，結(jié)果顯示Ad-pⅣ-CⅡTAm的效果接近Ad-CMV-CⅡTAm，能有效預(yù)防及治療EAT。這說(shuō)明CⅡTAm基因在pⅣ啟動(dòng)子調(diào)控下，在EAT病理發(fā)生過(guò)程能有效表達(dá)，并發(fā)揮抑制MHC-Ⅱ