活性維生素D3在小鼠實驗性自身免疫性肌炎的作用研究.pdf

1、特發(fā)性炎癥性肌病是一種具體原因尚不明確的累及肌肉為主的疾病，病理特征主要表現(xiàn)為受累肌肉或其他組織的變性壞死以及大量免疫細胞的異常浸潤,涉及到了細胞免疫和體液免疫以及其他非免疫因素和因子的活化以及參與。首選的主要治療藥物包括糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑；由于治療效果并不理想，且長時間的應(yīng)用伴隨較多甚至危重的副作用，因此需要積極探索確切的發(fā)病機制以及尋求治療效果較理想并且副作用較小的藥物。
　　維生素D3的主要活性形式是1,25(OH)2D

2、3，即骨化三醇。作為一種類固醇激素，其經(jīng)典的作用是通過鈣磷代謝的調(diào)節(jié)，從而維持機體骨骼的健康。近年來研究發(fā)現(xiàn)其具有神經(jīng)內(nèi)分泌激素作用，通過與細胞內(nèi)的維生素D受體（VDR）結(jié)合，可從多方面多途徑調(diào)節(jié)免疫功能和炎癥防御。研究發(fā)現(xiàn)其缺乏與多種自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)?；钚跃S生素D3還能影響多種效應(yīng)T細胞的功能：可抑制Th17細胞相關(guān)因子如IL-17和IL-6的表達；還可以誘導產(chǎn)生具有免疫抑制功能的Treg細胞，同時增加抗炎性細胞因子IL-

3、10和TGF-β的表達。
　　我們前期的研究顯示，改良實驗性自身免疫性肌炎模型(EAM)較好的模擬了多發(fā)性肌炎的病理特點；該實驗模型在造模開始到2周為小鼠肌炎的進展期，炎癥程度在2周達到高峰后逐漸緩解；前期研究顯示，促炎性Th17細胞和調(diào)節(jié)性Treg細胞的失衡及其相關(guān)的因子的變化與該疾病的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系。
　　活性維生素D3對肌炎的發(fā)展過程是否有抑制作用，目前尚未有研究報道。
　　目的：
　　觀察活性維生素

4、D3對肌炎模型小鼠的進展期和持續(xù)期是否有抑制作用；若有作用，探討活性維生素D3是否通過Th17和Treg細胞及其相關(guān)因子發(fā)揮作用；進一步與甲強龍的作用效果進行比較，為臨床特發(fā)性炎癥性肌病的治療提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　本實驗分為兩大組：2周處理組和4周處理組。2周處理組：BALB/c小鼠隨機分為5小組，每組5只，觀察14天。正常對照組未進行任何處理；模型組采用EAM模型處理；活性維生素D3干預組造模同時給予活性維生素D

5、3腹腔注射；甲強龍干預組造模同時給予甲強龍腹腔注射；聯(lián)合干預組造模同時給予甲強龍和活性維生素D3腹腔注射。4周處理組：分組同上，干預時間從造模第15天開始，干預方法同上，28天時觀察。
　　每組小鼠均進行一般狀況觀察、肌力評估和組織病理學評分；采用實時熒光定量PCR檢測各組小鼠肌肉、淋巴結(jié)和脾臟中Th17細胞相關(guān)因子IL-17、IL-6、IL-23和Treg細胞及其相關(guān)因子IL-10、TGF-β和Foxp3 mRNA的表達水平；采

6、用Luminex液相芯片技術(shù)檢測各組小鼠血清中相關(guān)細胞因子IL-17、IL-6和IL-23的表達水平。
　　結(jié)果：
　　1．與模型組比較，三種干預小鼠的肌力和肌肉組織的炎癥程度（病理學分值）無論在2周或4周均有所改善。改善程度由弱到強順序是骨化三醇組、甲強龍組、聯(lián)合干預組。雖然2周聯(lián)合干預的小鼠肌力和病理學得分好于甲強龍組，但沒有統(tǒng)計學差異（P>0.05）；但4周聯(lián)合干預的小鼠則顯著好于甲強龍組（P<0.05）。
　　

7、2．小鼠肌肉和淋巴結(jié)組織中各因子的 mRNA表達水平：與模型組相比，骨化三醇干預后，在2周和4周都可以減少Th17細胞相關(guān)因子IL-6、IL-17和IL-23的表達,有統(tǒng)計學差異（P<0.05）；甲強龍和聯(lián)合干預后更加降低了上述因子的表達，但兩組間無統(tǒng)計學差異（P>0.05）。與模型組相比，在2周時骨化三醇干預的Foxp3和IL-10的表達水平在炎性肌肉中增加,而 TGF-β的表達降低；甲強龍和聯(lián)合干預組IL-10表達繼續(xù)依次增加并且在

8、兩組間有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。與模型組相比在4周時，骨化三醇干預后Foxp3和TGF-β表達在淋巴結(jié)中增加；在甲強龍和聯(lián)合干預后TGF-β表達依次顯著增加,兩組間有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。
　　3．小鼠脾臟組織中各因子的 mRNA表達水平：與模型組相比，骨化三醇干預組在2周時 Th17細胞相關(guān)因子IL-17和IL-23的表達增加,而 IL-6的表達減低；Foxp3、IL-10和TGF-β的表達均增加,兩組間有統(tǒng)計學差異。

9、與模型組比較，甲強龍和聯(lián)合干預后的IL-17表達增加；IL-10以及TGF-β表達明顯增加且兩組間有統(tǒng)計學差異。4周處理的各組中，與模型組比較骨化三醇干預后IL-6、IL-23的表達減低，IL-17的表達增加，兩組間有統(tǒng)計學差異；而在甲強龍組和聯(lián)合干預組中，IL-6表達降低且有統(tǒng)計學差異。三組干預后的Foxp3的表達依次減低，IL-10和TGF-β表達逐漸增加；三組間無統(tǒng)計學差異。
　　4．在小鼠血清中，骨化三醇干預后IL-17、

10、IL-6和IL-23的表達降低。正常組三種因子的表達微量，模型組中三種因子的表達升高；而給予干預處理后該三種因子的表達相繼降低，與肌肉中的變化趨勢較一致，并且三組間有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1．無論是在進展期還是在持續(xù)期，骨化三醇干預后的肌炎模型小鼠的一般狀況、肌肉炎性浸潤程度都有所好轉(zhuǎn)；雖然改善程度不如甲強龍，但骨化三醇聯(lián)合甲強龍干預后的作用效果最好。
　　2．骨化三醇大致降低炎癥肌肉組織中IL

11、-17、IL-6和IL-23mRNA的表達水平，增加Foxp3、IL-10和TGF-βmRNA的表達水平，通過作用于Th17/Treg細胞相關(guān)因子來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，減輕小鼠機體特別是肌肉組織的炎性浸潤程度，從而改善小鼠的肌力和一般狀況。
　　3．與甲強龍組比較，聯(lián)合干預后脾臟組織中 Th17細胞相關(guān)因子的表達無明顯變化，而IL-10和TGF-βmRNA的表達水平明顯增加；提示骨化三醇是可能主要通過促進IL-10和TGF-β的表達