白介素-36α在自身免疫性心肌炎小鼠中的促炎作用.pdf

1、心肌炎(myocarditis)是一種心肌炎癥性疾病，主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞壞死和間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤，一般誘因有感染、自身免疫、中毒等，常累及心肌細(xì)胞、間質(zhì)及心臟瓣膜、心包，最終導(dǎo)致整個(gè)心臟結(jié)構(gòu)受損。因其復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制，臨床上表現(xiàn)為不同程度的胸悶、氣促、氣喘、心臟衰竭、猝死等多種癥狀。
　　病毒性心肌炎(Viral myocarditis，VMC)是一臨床常見心血管系統(tǒng)疾病。是由病毒感染引起心肌細(xì)胞的變性、壞死、間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤及纖維滲

2、出為主要病理改變的疾病。眾所周知VMC嚴(yán)重危害著人們的生命健康，然而迄今為止，由于VMC的發(fā)病機(jī)制還不完全清楚，對VMC的治療尚無有效的辦法，它涉及病毒的直接損傷、免疫機(jī)制、生化機(jī)制、心肌纖維化、細(xì)胞凋亡等，目前多數(shù)研究認(rèn)為病毒觸發(fā)的心肌自身免疫反應(yīng)(即自身免疫性心肌炎(Autoimmunemyocarditis，AMC)是VMC進(jìn)行性心肌損傷的主要原因。如何有效減輕這種免疫反應(yīng)損傷，成為VMC治療亟待解決的熱點(diǎn)問題。因此，闡明VMC的

3、發(fā)病機(jī)制具有重要的理論和實(shí)踐意義。
　　臨床上關(guān)于病毒性心肌炎的治療，主要以靜脈注射丙種球蛋白調(diào)節(jié)免疫狀態(tài)等減輕心肌損害和傳統(tǒng)的改善心肌能量代謝等方式，均無明確而有效的治療方式。近年來國內(nèi)外很多專家也進(jìn)行了各種嘗試，從不同的角度開展了大量針對治療該病藥物的實(shí)驗(yàn)研究，如共刺激分子的基因靶向治療或抑制炎癥因子、調(diào)節(jié)氧化還原反應(yīng)藥物、調(diào)節(jié)Th1/Th2炎癥因子的分泌藥物、抑制心肌重構(gòu)藥物的探索與開發(fā)等，試圖在治療方面有所突破。隨著對細(xì)胞

4、因子研究的不斷深入，越來越多的專家將治療心肌炎的目光聚集在了應(yīng)用細(xì)胞因子治療上，而且這種方法也獲得了一定的研究成果。目前已應(yīng)用到臨床的細(xì)胞因子有重組白介素-2，重組干擾素等。
　　IL-36是最近才被命名的IL-1家族新成員，由3個(gè)生物學(xué)功能相似的分子IL-36α、IL-36β及IL-36γ組成，IL-36Ra是其天然拮抗劑。IL-36成員的共同受體為IL-36R，可與IL-1受體輔助蛋白(IL-1RAcP)相結(jié)合形成二聚體。細(xì)胞

5、外IL-36不跨膜蛋白IL-36R及IL-1RAcP的胞外結(jié)構(gòu)結(jié)合后形成復(fù)合物，通過胞內(nèi)區(qū)功能域與接頭蛋白髓樣分化蛋白88(myeloid differentiationprimary response88，MyD88)結(jié)合，活化MAPKs、NF-κB信號級聯(lián)途徑，發(fā)揮促炎、活化免疫反應(yīng)的作用。研究顯示，IL-36成員免疫調(diào)理及免疫激活作用較傳統(tǒng)IL-1家族成員更強(qiáng)，是樹突細(xì)胞和T細(xì)胞的強(qiáng)效調(diào)節(jié)劑，參與樹突細(xì)胞與Th細(xì)胞的激活、抗原提呈

6、和刺激促炎因子產(chǎn)生，在免疫反應(yīng)中具有巨大的潛能。主要表現(xiàn)在①對免疫細(xì)胞的作用:在體外，小鼠的骨髓來源樹突樣細(xì)胞(BMDC)和CD4+T細(xì)胞能對IL-36產(chǎn)生明顯的特異性反應(yīng)，IL-36激活CD4+T細(xì)胞中Th1細(xì)胞反應(yīng);在體內(nèi)，IL-36能促進(jìn)樹突細(xì)胞的成熟，上調(diào)樹突細(xì)胞表面MHC-Ⅱ和共刺激分子CD80/CD86的表達(dá)，增強(qiáng)樹突細(xì)胞抗原提呈功能，并刺激Th0細(xì)胞向Th1細(xì)胞分化。Nicklin等研究表明，在促進(jìn)抗原提呈方面樹突細(xì)胞對I

7、L-36的反應(yīng)比對IL-1更強(qiáng)烈。Th1和Th2細(xì)胞表達(dá)IL-36R mRNA水平較IL-1高。②對細(xì)胞因子的作用:鼠骨髓源性樹突細(xì)胞(BMDCs)和CD4+T細(xì)胞持續(xù)性表達(dá)IL-36R，當(dāng)受到IL-36刺激，BMDCs產(chǎn)生促炎癥性細(xì)胞因子如IL-12、IL-18、IL-6、TNF-γ、IL-23等，CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生INF-γ、IL-4、IL-17等，這些應(yīng)答反應(yīng)均可被IL-36Ra所拮抗。
　　目前IL-36和自身免疫病之間的

8、關(guān)系，在心血管系統(tǒng)尚未見報(bào)道。心肌Ⅱ-肌球蛋白重鏈的肽段誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌(Experimental autoimmunemyocarditis，EAM)動物模型主要用于研究自身免疫機(jī)制在心肌炎發(fā)病及進(jìn)展過程中的作用。該模型主要通過人為誘發(fā)靶向心肌的自身免疫而致病，因其剔除了其他復(fù)雜感染因素的影響，可專門用于自身免疫機(jī)制致病的研究，為研究心臟特異性免疫反應(yīng)和心肌炎癥損害提供了極好的實(shí)驗(yàn)動物模型。本研究通過皮下注射心肌α-肌球蛋白

9、重鏈短肽免疫BALB/c小鼠誘導(dǎo)AMC，將實(shí)驗(yàn)小鼠在造模第15天，分別予IL-36α和IL-36Ra連續(xù)腹腔注射7天，于第21天行小鼠心臟超聲檢查，酶聯(lián)免疫吸附法測定血清炎癥因子IL-23、IL-17濃度;蘇木精-伊紅(HE)染色檢查心肌病理改變。觀察IL-36α對小鼠AMC模型免疫反應(yīng)的作用，旨在探討IL-36α在AMC發(fā)病機(jī)制中的作用，為AMC的防治提供新思路。
　　第一章 IL-36α在自身免疫性心肌炎過程中的表達(dá)及與心肌損

10、傷程度關(guān)系研究
　　目的:
　　選用BALB/c小鼠構(gòu)建實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎(AMC)動物模型，明確AMC時(shí)IL-36α表達(dá)上調(diào)與心肌免疫損傷之間的關(guān)系。
　　方法:
　　1.野生型雄性BALB/c小鼠（六周齡），體重14-18g之間，購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心(SPF級環(huán)境下飼養(yǎng))。所有實(shí)驗(yàn)動物操作流程均獲得實(shí)驗(yàn)動物保護(hù)權(quán)威機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn)，并遵循南方醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)準(zhǔn)則。
　　2.AMC動物模型的構(gòu)建

11、將24只BALB/c小鼠隨機(jī)分成4組，其中包括:正常對照組（C組）;低劑量短肽組（L組）;中劑量短肽組（M組）;高劑量短肽組（H組）。其中后3組小鼠共18只于不同時(shí)間先后2次用特異的短肽免疫構(gòu)建實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎動物模型，該特異的短肽為小鼠心肌肌球蛋白重鏈α-(MyHc-a614-629[Ac-S LKLM ATLFSTYAS AD-OH])。計(jì)劃在實(shí)驗(yàn)第0天和第7天時(shí)每一只實(shí)驗(yàn)小鼠采用背部皮下注射的方式分別注射準(zhǔn)備好的含有短肽的乳

12、化劑共2次。接種后觀察大鼠的活動、飲食、毛色及體重變化。分別于首次接種免疫劑后的第14天、21天到B超功能檢查室給小鼠做心臟超聲檢察、采用Western blot檢測心肌IL-36α蛋白表達(dá)、給實(shí)驗(yàn)小鼠心臟組織切取的標(biāo)本做蘇木素-伊紅染色及顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)后完成病理學(xué)評分。
　　結(jié)果:
　　在自身免疫性心肌炎的實(shí)驗(yàn)動物模型中，用小鼠心肌肌球蛋白重鏈α-衍生的肽和免疫的弗氏完全佐劑乳化的BALB/c小鼠中誘導(dǎo)的心肌炎，IL-

13、36α在普通小鼠心肌有低水平表達(dá)，而在AMC小鼠模型中IL-36α表達(dá)明顯增多;并且隨著IL-36α表達(dá)增多，心肌炎損傷程度也加重。
　　結(jié)論:
　　1.應(yīng)用小鼠心肌肌球蛋白重鏈α-衍生的肽免疫BALB/c小鼠可成功的建立EAM模型。
　　2.AMC過程中IL-36α與心肌損傷程度呈正相關(guān)
　　第二章 IL-36α促進(jìn)AMC小鼠心功能惡化
　　目的:
　　探討白介素-36α在自身免疫性心肌炎(auto

14、immune myocardioptis，AMC)小鼠中的促炎作用。
　　方法:
　　1.將40只BALB/c小鼠隨機(jī)分為對照組（Ctrl組）、AMC組、AMC+IL-36α組和AMC+IL-36Ra組。取200μg肌球蛋白重鏈短肽免疫小鼠建AMC模型，在小鼠建模第15天，后兩組分別接受IL-36α和IL-36Ra（0.1ug/只/d）連續(xù)7天腹腔注射，對照組與AMC組小鼠僅接受等劑量生理鹽水腹腔注射。于實(shí)驗(yàn)第21天檢查小鼠

15、各項(xiàng)指標(biāo)。
　　2.經(jīng)胸心臟超聲檢查:將這些小鼠先麻醉，測量完每只小鼠體重后，經(jīng)胸做超聲心動圖檢測，分別測量收縮末期和舒張末期左室內(nèi)徑，通過儀器計(jì)算自動獲取左室內(nèi)射血分?jǐn)?shù)和左室短軸縮短率。
　　3.蘇木素-伊紅(HE)染色檢查心肌病理改變:安樂死所有實(shí)驗(yàn)小鼠，將心臟標(biāo)本浸泡在福爾馬林中24小時(shí)，后經(jīng)石蠟包理、切片，行蘇木素和伊紅染色。
　　4.酶聯(lián)免疫吸附法測定血清IL-23、IL-17濃度:酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒檢測

16、各組小鼠血清中的白介素-23(IL-23)和白介素-17(IL-17)水平。
　　結(jié)果:
　　成功建立小鼠AMC模型后，與Ctrl組相比，實(shí)驗(yàn)組小鼠出現(xiàn)不同程度的心功能不全，血清IL-23、IL-17水平均明顯增高，心肌病理切片可見炎癥細(xì)胞浸潤，其中又以AMC+IL-36α組小鼠炎癥因子上升、炎癥細(xì)胞浸潤增加及心功能不全最明顯，而較AMC組，AMC+IL36Ra組小鼠的各項(xiàng)指標(biāo)被顯著抑制。
　　結(jié)論:
　　1.A

17、MC過程前加入外源性重組IL-36α，免疫應(yīng)答增強(qiáng)，加重心肌損傷。
　　2.AMC過程中加入IL-36RA阻斷IL-36α，可抑制免疫應(yīng)答，減輕心肌損傷。
　　總結(jié):
　　1.通過皮下注射心肌α-肌球蛋白重鏈短肽免疫BALB/c小鼠可成功誘導(dǎo)AMC。
　　2.IL-36α的表達(dá)上調(diào)可加重AMC小鼠心肌炎癥損傷程度。
　　3.IL-36α作為促炎因子在AMC自身免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，它通過促進(jìn)T細(xì)胞增殖及細(xì)