水稻愈傷組織的誘導(dǎo)[畢業(yè)設(shè)計]

1、<p>　　本科畢業(yè)設(shè)計(論文)</p><p><b>　?。ǘ?屆）</b></p><p><b>　　水稻愈傷組織的誘導(dǎo)</b></p><p>　　所在學(xué)院 </p><p>　　專業(yè)班級 生物工程

2、 </p><p>　　學(xué)生姓名 學(xué)號 </p><p>　　指導(dǎo)教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 </p><p><b>　　水稻組織培養(yǎng)</b>&l

3、t;/p><p>　　摘要：水稻組織培養(yǎng)技術(shù)在生物技術(shù)的研究中已經(jīng)被廣泛應(yīng)用了。在這篇論文中，我們采用水稻種子作為外植體在培養(yǎng)基中進(jìn)行水稻繁殖。在未來研究中，我們將繼續(xù)增加誘導(dǎo)頻率，以期更好的利用于轉(zhuǎn)基因研究上。關(guān)鍵詞：水稻；外植體；組織培養(yǎng)</p><p>　　The rice tissue culture</p><p>　　Abstract: The rice

4、tissue culture technique has been widely used in biotechnique research.In this report，we use rice seed as explants to determine the medium for rice generation culture .In further research ，we will continue to improve the

5、 induction frequency and make it better use on the rice transformation research.Keywords: rice; Tissue culture; explants</p><p><b>　　目 錄</b></p><p><b>　　摘要1</b></p&

6、gt;<p>　　Abstract1</p><p><b>　　1 緒論1</b></p><p>　　1.1 關(guān)于水稻愈傷組織的簡介1</p><p>　　1.2 組織培養(yǎng)1</p><p>　　1.3 愈傷組織的形成2</p><p>　　1.4 水稻愈傷組

7、織的誘導(dǎo)2</p><p>　　1.5 目前水稻組織培養(yǎng)中存在的問題3</p><p>　　1.6 論文目標(biāo)3</p><p>　　1.7 相關(guān)研究的最新成果及動態(tài)4</p><p><b>　　2 實驗部分6</b></p><p>　　2.1 實驗流程6</p>

8、<p>　　2.2 實驗設(shè)備和材料6</p><p>　　2.2.1 實驗設(shè)備6</p><p>　　2.2.2 實驗材料6</p><p>　　2.2.3 實驗試劑6</p><p>　　2.3 實驗內(nèi)容8</p><p>　　2.3.1 配制培養(yǎng)基8</p>&l

9、t;p>　　2.3.2 消毒10</p><p>　　2.3.3 水稻愈傷組織培養(yǎng)10</p><p>　　3 結(jié)果與分析11</p><p>　　3.1 不同激素濃度對水稻愈傷組織生長的影響11</p><p>　　3.2 不同濃度激素對水稻愈傷組織分化的影響13</p><p>　　致 謝

10、錯誤!未定義書簽。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)16</b></p><p><b>　　1 緒論</b></p><p>　　1.1 關(guān)于水稻愈傷組織的簡介</p><p>　　水稻是人們重要的食糧之一，由于其基因組小，通過組織培養(yǎng)易獲得再生植株等特點而在基因克隆、基因功能驗證以

11、及遺傳轉(zhuǎn)化等研究方面成為模式植物。生長和分裂旺盛的胚性愈傷組織細(xì)胞培養(yǎng)是獲得轉(zhuǎn)基因植物的最好來源。因此，建立一個高效再生體系是實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化的先決條件[1]。近年來，研究者先后從水稻各部位誘導(dǎo)出愈傷組織和再生植株。雖然，幼穗、幼胚、花粉粒、花藥愈傷組織誘導(dǎo)率高，愈傷組織質(zhì)量好而受到青睞被廣泛用于水稻的遺傳轉(zhuǎn)化、品種培育中[2-3]。但上述材料多受季節(jié)限制，取材不便，阻礙了水稻組織培養(yǎng)的進(jìn)一步發(fā)展。</p><p>

12、<b>　　1.2 組織培養(yǎng)</b></p><p>　　所謂的植物組織培養(yǎng)是指在無菌和人工控制的環(huán)境條件下，利用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基對離體的植物器官組織細(xì)胞及原生質(zhì)體進(jìn)行培養(yǎng)，使其再生細(xì)胞或完整植株的技術(shù)[4]。其研究的類型主要包括組織培養(yǎng)、器官培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)、及原生質(zhì)體培養(yǎng)。隨著研究T作的深入進(jìn)展，上述5個方面的研究理論和技術(shù)體系逐漸得到完善促使植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用范圍日益廣闊延伸。組織培養(yǎng)作為

13、一種育種技術(shù)在水稻等重要糧食作物已廣泛應(yīng)用，并培育出一大批優(yōu)良品種，自1965年我國開展水稻細(xì)胞培養(yǎng)研究后，研究者以水稻幼穗、幼胚、花粉粒和花藥為材料進(jìn)行組織培養(yǎng)研究，取得了較大的進(jìn)展，尤其是建立起來的水稻胚性懸浮細(xì)胞系可作為基閃槍的理想受體，在水稻的遺傳轉(zhuǎn)化，品種培育巾具有重要作用。</p><p>　　再如細(xì)胞次生代謝物的生產(chǎn)，即通過細(xì)胞培養(yǎng)可得到大量合成的植物次生化合物，如生物堿、抗菌劑、利血平、橡膠、類同

14、醇、糖類衍生物、天然色素等很多物質(zhì)。遠(yuǎn)源雜種植物的產(chǎn)生，是指由受精后障礙導(dǎo)致遠(yuǎn)緣雜交的植物不孕，使得植物的種間和遠(yuǎn)緣雜交常難以成功。采用胚的早期離體培養(yǎng)可以使雜種胚正常發(fā)育，產(chǎn)生遠(yuǎn)緣雜交后代，從而育成新物種。植物的快速繁殖，是指利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)對外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)，使其短期內(nèi)獲得遺傳性一致的大量再生植株的方法。植物快速繁殖是植物組織培養(yǎng)技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最廣泛，產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)效益最大的研究領(lǐng)域，涉及的植物種類繁多，技術(shù)日益成熟并程序化，

15、繁殖速度突破了植物自然繁殖的界限，成就了工廠育苗的夢想。</p><p>　　水稻種子成熟胚經(jīng)誘導(dǎo)形成愈傷組織，進(jìn)而分化成苗的報道十分常見。粳稻出愈率與分化率一般都要高于秈稻，現(xiàn)階段多以粳稻為實驗材料。為了提高水稻愈傷的出苗率，有采用干燥處理[5]，輻射處理[6]，添加銅、銀元素[7-8]，添加脯氨酸[9]，添加MET(多效唑)[10]和添加活性碳[11]等方法.</p><p>　　兩種

16、方法較費時，輻射處理方法還需要特定的儀器，而且這幾種方法只是對特定品種的水稻有顯著作用，并不適合任意品種的水稻。</p><p>　　植物種質(zhì)資源的離體保存，即從20世紀(jì)60年代開始，人們利用細(xì)胞和組織培養(yǎng)再生植株的技術(shù)，進(jìn)行了離體保存種質(zhì)的研究。種質(zhì)資源離體保存是指對離體培養(yǎng)的小植株、器官、組織、細(xì)胞或原生質(zhì)體等材料，采用限制、延緩或停止其生長的處理使之保存，在需要時可重新恢復(fù)其生長，并再生植株的方法。為了創(chuàng)造

17、新的種質(zhì)資源，組織培養(yǎng)及基因工程技術(shù)被廣泛用于水稻育種研究，并取得了顯著成果，如現(xiàn)代生物技術(shù)育種過程中常作為外源基因的受體的愈傷組織，其質(zhì)量的好壞及其分化植株能力的高低直接影響著水稻基因工程的進(jìn)展和水稻種質(zhì)資源的創(chuàng)新。在改善愈傷組織質(zhì)量和提高植株再生能力方面，科學(xué)工作者也進(jìn)行了大量研究并得到了一定的成果[12]。目前水稻的組織培養(yǎng)已在單倍體育種、誘變育種、體細(xì)胞雜交及遺傳轉(zhuǎn)化等方面得到應(yīng)用。</p><p>　　

18、1.3 愈傷組織的形成</p><p>　　從一塊外植體形成典型的愈傷組織，大致要經(jīng)歷三個時期：起動期、分裂期和形成期起動期是指細(xì)胞準(zhǔn)備進(jìn)行分裂的時期。用于接種的外植體的細(xì)胞，通常都是成熟細(xì)胞，處在靜止?fàn)顟B(tài)。起動期是通過一些刺激因素(如機械損傷、改變光照強度、增加氧等)和激素的誘導(dǎo)作用，使外植體細(xì)胞的合成代謝活動加強，迅速進(jìn)行蛋白質(zhì)和核酸的合成。機械損傷能誘導(dǎo)植物體細(xì)胞開始分裂，如傷口上會出現(xiàn)愈傷組織。在植物組

19、織培養(yǎng)中沿用了愈傷組織這一名詞，但是植物組織培養(yǎng)中誘導(dǎo)外植體細(xì)胞分裂形成的愈傷組織，大都不是損傷的結(jié)果。外源的生長素類物質(zhì)對誘導(dǎo)細(xì)胞開始分裂效果很好，因此生長素類物質(zhì)在植物組織培養(yǎng)中得到廣泛應(yīng)用，常用的有2，4-二氯苯氧乙酸、萘乙酸、吲哚乙酸和細(xì)胞分裂素等。</p><p>　　分裂期是指外植體細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)以后脫分化，不斷分裂、增生子細(xì)胞的過程。處于分裂期的愈傷組織的特點是：細(xì)胞分裂快，結(jié)構(gòu)疏松，顏色淺而透明。&

20、lt;/p><p>　　外植體的脫分化因植物種類、器官來源及其生理狀況的不同而有很大差別。例如，煙草、胡蘿卜等植物的脫分化比較容易，禾本科植物的脫分化比較難；花的脫分化比較容易，莖、葉的脫分化比較難；幼嫩組織的脫分化比較容易，成熟的老組織脫分化比較難。</p><p>　　1.4 水稻愈傷組織的誘導(dǎo)</p><p>　　水稻成熟胚愈傷組織誘導(dǎo)中普遍采用的基本培養(yǎng)基主要

21、有MS、N6 和B5 等培養(yǎng)基。培養(yǎng)溫度一般為22~28℃，25℃左右最佳；光照強度為1 500~2 000 Lx，可以選用日光燈或白熾燈，光照時間10~12 h 或全黑暗培養(yǎng)均可，10~30 d 可誘導(dǎo)出愈傷組織。</p><p>　　在水稻成熟胚的愈傷組織誘導(dǎo)過程中，為了保持愈傷組織的高速生長，常用到生長素類和細(xì)胞分裂素類物質(zhì)。其中2，4-D 是禾谷類作物愈傷組織誘導(dǎo)中唯一不可缺少的激素種類，其作用的適宜濃度

22、范圍為0.5~5.0 mg/L，也有例外。在附加有6.0 mg/L 2，4-D和0.5 mg/L KT 的MS 培養(yǎng)基上誘導(dǎo)出了大量小麥幼胚胚性愈傷組織。在培養(yǎng)基中添加一定濃度的ABA，對抑制胚芽和根的生長有明顯效果，且能顯著提高成熟胚愈傷組織的誘導(dǎo)率，ABA 濃度為2mg/L 時誘導(dǎo)率最高。當(dāng)ABA 濃度大于5mg/L 后，其愈傷誘導(dǎo)率開始下降。</p><p>　　通常通過成熟胚誘導(dǎo)的初生愈傷組織并不適于懸浮

23、細(xì)胞培養(yǎng)，一般需要3~6 周的繼代培養(yǎng)，改良愈傷組織的形態(tài)。為了獲得松脆，小顆粒和快速生長愈傷組織細(xì)胞，也可以采用相對較短的繼代周期或?qū)⒋髩K愈傷組織夾碎攤平等物理手段。固體繼代次數(shù)對細(xì)胞懸浮系的建立至關(guān)重要。有研究表明，愈傷組織在固體培養(yǎng)基上繼代7 次后形成的懸浮系與繼2 次后形成的懸浮系相比，前者明顯好于后者，適當(dāng)?shù)卦黾永^代次數(shù)有利于愈傷組織細(xì)胞形態(tài)的改變。</p><p>　　1.5 目前水稻組織培養(yǎng)中存在

24、的問題</p><p>　　在水稻組織培養(yǎng)方面，我國科學(xué)家已克服了一道道難關(guān)，但在發(fā)展中還存在一系列問題，有待進(jìn)一步探索。例如在目前的技術(shù)水平下，對水稻細(xì)胞無性系還雉以進(jìn)行定向誘變，直至目前還沒弄清體細(xì)胞無性系變異的規(guī)律，給細(xì)胞無性系變異育種帶來一定的困難[13]。</p><p>　　水稻的愈傷組織是進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化改良水稻品質(zhì)的重要方法之一。但是長期繼代培養(yǎng)引起愈傷組織再生能力衰退是一個已

25、被很多學(xué)者所認(rèn)識和重視的問題，針對其衰退的原因也有比較深入的生理生化研究[14-17]，但筆者認(rèn)為它仍是一個有待進(jìn)一步研究攻關(guān)解決的問題。</p><p>　　在水稻的組織培養(yǎng)和器官培養(yǎng)中花藥離體培養(yǎng)作為一種新的育種手段，在水稻育種中得到應(yīng)用。我國是世界上首先將水稻花培品種應(yīng)用于生產(chǎn)的國家，現(xiàn)已育成一批優(yōu)質(zhì)高抗的水稻優(yōu)良品種，并取得了較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。花藥培養(yǎng)誘導(dǎo)出的單倍體，表現(xiàn)出雙親性狀的各種重組類型，

26、通過自然加倍或人工加倍，可以在當(dāng)代獲得穩(wěn)定得純合二倍體，大大加快了育種速度。但在實際操作中，由于受培養(yǎng)基組分、材料的差異性以及培養(yǎng)環(huán)境的影響，往往獲得的再生植株群體較小，使選擇受到較大的限制[18]。并且水稻花藥培養(yǎng)會產(chǎn)生大量的白化苗，有的甚至達(dá)80％一90％，成為花藥培養(yǎng)研究和育種的重要障礙，以上諸多原因都是水稻的組織和器官在離體培養(yǎng)的情況下，建立禾本科植物再生體系以及轉(zhuǎn)基因育種中存在的問題。</p><p>

27、<b>　　1.6 論文目標(biāo)</b></p><p>　　水稻是人們重要的糧食作物之一，也是經(jīng)典的模式植物。生長和分裂旺盛的胚性愈傷組織細(xì)胞培養(yǎng)是獲得轉(zhuǎn)基因植物的最好來源。近年來，研究者先后從水稻各部位誘導(dǎo)出愈傷組織和再生植株。雖然，幼穗、幼胚、花粉粒、花藥愈傷組織誘導(dǎo)率高，愈傷組織質(zhì)量好而受到青睞，但上述材料多受季節(jié)限制，取材不便，阻礙了水稻組織培養(yǎng)的進(jìn)一步發(fā)展。</p>&

28、lt;p>　　本實驗以本省粳稻種子為材料，對其在不同培養(yǎng)基條件下的出愈率及愈傷組織狀態(tài)進(jìn)行研究，以期獲得狀態(tài)較好的愈傷組織，為進(jìn)一步利用其進(jìn)行懸浮細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)基因研究提供理論及實驗依據(jù)。</p><p>　　1.7 相關(guān)研究的最新成果及動態(tài) </p><p>　　自1965年我國開展水稻細(xì)胞培養(yǎng)研究后，研究者以水稻幼穗、幼胚、花粉粒和花藥為材料進(jìn)行組織培養(yǎng)研究，取得了較大的進(jìn)展，尤

29、其是建立起來的水稻胚性懸浮細(xì)胞系可作為基閃槍的理想受體，在水稻的遺傳轉(zhuǎn)化，品種培育巾具有重要作用。</p><p>　　再如細(xì)胞次生代謝物的生產(chǎn)，即通過細(xì)胞培養(yǎng)可得到大量合成的植物次生化合物，如生物堿、抗菌劑、利血平、橡膠、類同醇、糖類衍生物、天然色素等很多物質(zhì)。遠(yuǎn)源雜種植物的產(chǎn)生，是指由受精后障礙導(dǎo)致遠(yuǎn)緣雜交的植物不孕，使得植物的種間和遠(yuǎn)緣雜交常難以成功。采用胚的早期離體培養(yǎng)可以使雜種胚正常發(fā)育，產(chǎn)生遠(yuǎn)緣雜交后

30、代，從而育成新物種。植物的快速繁殖，是指利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)對外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)，使其短期內(nèi)獲得遺傳性一致的大量再生植株的方法。植物快速繁殖是植物組織培養(yǎng)技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用最廣泛，產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)效益最大的研究領(lǐng)域，涉及的植物種類繁多，技術(shù)日益成熟并程序化，繁殖速度突破了植物自然繁殖的界限，成就了工廠育苗的夢想。</p><p>　　植物種質(zhì)資源的離體保存，即從20世紀(jì)60年代開始，人們利用細(xì)胞和組織培養(yǎng)再生植株的技術(shù)

31、，進(jìn)行了離體保存種質(zhì)的研究。種質(zhì)資源離體保存是指對離體培養(yǎng)的小植株、器官、組織、細(xì)胞或原生質(zhì)體等材料，采用限制、延緩或停止其生長的處理使之保存，在需要時可重新恢復(fù)其生長，并再生植株的方法。為了創(chuàng)造新的種質(zhì)資源，組織培養(yǎng)及基因工程技術(shù)被廣泛用于水稻育種研究，并取得了顯著成果，如現(xiàn)代生物技術(shù)育種過程中常作為外源基因的受體的愈傷組織，其質(zhì)量的好壞及其分化植株能力的高低直接影響著水稻基因工程的進(jìn)展和水稻種質(zhì)資源的創(chuàng)新。在改善愈傷組織質(zhì)量和提高植

32、株再生能力方面，科學(xué)工作者也進(jìn)行了大量研究并得到了一定的成果。目前水稻的組織培養(yǎng)已在單倍體育種、誘變育種、體細(xì)胞雜交及遺傳轉(zhuǎn)化等方面得到應(yīng)用。</p><p><b>　　2 實驗部分</b></p><p>　　2.1 實驗流程 </p><p>　?、艑⑷しN子進(jìn)行消毒，然后接種于NB培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織</p><

33、p>　　⑵挑選顆粒狀小愈傷組織于MS培養(yǎng)基中，進(jìn)行分化培養(yǎng)</p><p>　　(3)獲得具有良好的再生能力的胚性愈傷組織</p><p>　　2.2 實驗設(shè)備和材料</p><p>　　2.2.1 實驗設(shè)備</p><p>　　QYC 211 搖床；上海福瑪實驗設(shè)備有限公司2.2.2 </p><p>　

34、　AL204 電子天平；梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司</p><p>　　DZF-6050 真空干燥箱；上海精宏實驗設(shè)備有限公司</p><p>　　YXQ-LS-SH 全自動立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋；上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠</p><p>　　2.2.2 實驗材料</p><p>　　春江早6號來自于中國水稻研究所</p

35、><p>　　2.2.3 實驗試劑</p><p>　　⑴NB培養(yǎng)基母液（成分、濃度如表1）</p><p>　　表1 MS培養(yǎng)基母液成分、濃度</p><p>　　⑵MS培養(yǎng)基母液（成分濃度如表2）</p><p>　　表2 MS培養(yǎng)基母液成分、濃度</p><p>　　其他：70%酒精、1

36、0%次氯酸鈉、0.1%升汞、蔗糖（30g/L）、3mg/LBAP、0.5mg/LNAA、瓊脂。</p><p><b>　　2.3 實驗內(nèi)容</b></p><p>　　2.3.1 配制培養(yǎng)基</p><p>　　NB培養(yǎng)基基本成分：N6培養(yǎng)基大量元素、B5培養(yǎng)基微量元素及有機成分，脯氨酸(500mg/L)，水解酪蛋白（300mg/L），蔗

37、糖（30mg/L），植物凝膠（phytagel2.6g/L）。</p><p>　　愈傷誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)基：NB培養(yǎng)基基本成分，以NB為基本培養(yǎng)基，附加一定種類和質(zhì)量濃度的激素(見表3)以及適量的脯氨酸、水解酪蛋白、谷氨酰氨和蔗糖。調(diào)pH至5．8，高溫高壓滅菌，倒入已滅菌的培養(yǎng)皿中備用。</p><p>　　表3 不同激素濃度配比的培養(yǎng)基</p><p>　　注：D

38、1B1表示2，4-D的質(zhì)量濃度為1.0 mg/L，6-BA的質(zhì)量濃度為1 mg/L，其余類推。</p><p>　　分化培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基基本成分，另外6-BA，NAA（見表4）。</p><p>　　表4 不同激素濃度配比的培養(yǎng)基</p><p>　　以下是MS培養(yǎng)基的基本培植過程：</p><p>　?。?）將配制好的MS培養(yǎng)基母液從冰

39、箱中取出，按順序排列，并逐一檢查是否沉淀或變色，避免使用已失效的母液。</p><p>　?。?）取少量的蒸餾水（約為配制培養(yǎng)基量的2/3）加入燒杯中。（注意：配500ml培養(yǎng)基用1000ml燒杯。）</p><p>　?。?）按母液順序和規(guī)定量，用量筒、移液管或微量移液器取母液，依次放入燒杯中。</p><p>　　配制1000ml培養(yǎng)基：</p>

40、<p>　　需：MS大量元素母液 100ml</p><p>　　MS微量元素母液 10ml</p><p>　　MS鐵鹽母液 10ml</p><p>　　MS有機物母液 10ml</p><p>　?。?）加入大約20ml 3mg/L BAP，0.5mg/LNAA

41、等生長素</p><p>　　（5）加入蔗糖（30g/L），溶解。</p><p>　　（6）定容：用容量瓶。</p><p>　　（7）調(diào)pH值：一般pH=5.8。</p><p>　　注意：①經(jīng)高溫高壓滅菌后，培養(yǎng)基的pH值會下降0.2—0.8，故調(diào)整后的pH值應(yīng)高于目標(biāo)pH值0.5個單位。</p><p>　?、?/p>

42、pH值的大小會影響瓊脂的凝固能力，一般當(dāng)pH大于6.0時，培養(yǎng)基將會變硬；低于5.0時，瓊脂就不能很好地凝固。</p><p>　?、廴绻鹥H值與所需的數(shù)值相差很大，可先用0.5N的NaOH或HCl調(diào)節(jié)，至接近時，再用0.1N的酸、堿調(diào)節(jié)。以免加入過量的水溶液，導(dǎo)致溶液體積增大，培養(yǎng)基不能很好地凝固（因加入的瓊脂量一定）。</p><p>　?。?）分裝到大三角瓶中（500ml、1000m

43、l）。</p><p>　?。?）加瓊脂（6-10g/L），常用6.6--7 g/L</p><p>　?。?0）封口：用棉塞或錫箔紙、牛皮紙。注明培養(yǎng)基名稱、配制時間。</p><p><b>　　2.3.2 消毒</b></p><p>　　外植體在接種之前，須經(jīng)嚴(yán)格滅菌。目前外植體滅菌多采用酒精和升汞，其中酒精具

44、有較強的殺菌力、穿透力和濕潤作用。酒精和升汞處理的時間過長或過短都不利于滅菌，過短滅菌不徹底，過長雖然污染率降低但也會影響愈傷組織誘導(dǎo)率，所以應(yīng)嚴(yán)格把握滅菌的時間。滅菌組合方式采用如下方法：</p><p>　　(1)先將去殼種子用70%酒精消毒3 min，再用0. 1%氯化汞消毒15～18min，最后用無菌水洗凈；</p><p>　　(2)然后用70%酒精浸泡種子1 min，然后用2.

45、 5% NaClO 浸泡20 ～30 min，用無菌水沖洗種子4～5次，并浸泡過夜；</p><p>　　(3)70%乙醇1min、10%次氯酸鈉30-40min、0.1%升汞5-7min進(jìn)行表面消毒，最后用無菌水沖洗3-4次。</p><p>　　2.3.3 水稻愈傷組織培養(yǎng)</p><p>　　（1）將消毒過的水稻去殼種子接種于愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，置于25

46、 ℃黑暗條件下培養(yǎng)。 </p><p>　?。?）3-4周后，觀察實驗現(xiàn)象，統(tǒng)計出增重率：增重率=（末重-初重）/初重*100。</p><p>　　挑選顆粒狀小愈傷組織與MS培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，每星期更換一次培養(yǎng)基并去除生長緩慢的大塊愈傷組織。</p><p>　　每天觀察愈傷組織生長情況，并統(tǒng)計出苗情況。</p><p><b>

47、　　3 結(jié)果與分析</b></p><p>　　3.1 不同激素濃度對水稻愈傷組織生長的影響</p><p>　　表5 不同激素濃度配比的愈傷組織</p><p>　　圖1 愈傷組織生長情況</p><p>　　圖2 愈傷組織生長情況</p><p>　　生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的調(diào)節(jié)對愈傷組織的誘導(dǎo)以及生長很

48、重要。在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中摻入少量激素可提高愈傷組織的質(zhì)量，并有利于以后的分化。本實驗在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加了不同濃度的2，4-D和6-BA，由表5刻發(fā)現(xiàn)，兩種激素濃度的不同配比對愈傷組織的誘導(dǎo)效果棉線不同。當(dāng)2，4-D濃度為2 mg/L，6-BA濃度為1 mg/L時，水稻愈傷組織的增重率最高，達(dá)273.99。當(dāng)2，4-D濃度為1 mg/L，6-BA濃度為1.5mg/L時，水稻愈傷組織出愈率僅為142.42。此外，改變2，4-D和6-BA的濃度配

49、比，水稻愈傷組織的出愈率均受到不同程度的影響．當(dāng)2，4-D濃度固定，隨著6-BA濃度的增加，水稻的出愈率明顯降低；當(dāng)6-BA的濃度固定，2，4-D濃度依次為1 mg/L、2 mg/L、4 mg/L時，水稻愈傷組織的出愈率呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。由此可見，不同植物激素對水稻愈傷組織的誘導(dǎo)存在明顯差異，因此，植物激素的合理配比對愈傷組織的誘導(dǎo)起著關(guān)鍵性的作用。</p><p>　　根據(jù)上述圖表顯示，我們可以得出結(jié)論當(dāng)

50、2，4-D濃度為2 mg/L，6-BA濃度為1 mg/L時，其增重率最高，所以我們選擇這一組數(shù)據(jù)作為水稻愈傷組織誘導(dǎo)的最佳激素配比。</p><p>　　3.2 不同濃度激素對水稻愈傷組織分化的影響</p><p>　　表6 培養(yǎng)基中愈傷組織分化情況</p><p>　　圖3 愈傷組織分化情況</p><p>　　圖4 愈傷組織分化情況&l

51、t;/p><p>　　水稻愈傷組織分化情況見表6。</p><p>　　比較培養(yǎng)基1號、2號和3號，添加的細(xì)胞分裂素6-BA的量不同，1號中愈傷組織出現(xiàn)綠點最早，2號其次，3號中沒有出現(xiàn)綠點；1號出苗，2號不出苗；1號中有較多根狀物，2號中較少，3號中沒有根狀物。</p><p>　　比較培養(yǎng)基l號、4號和5號，添加的生長素NAA的量不同，1號中愈傷組織出現(xiàn)綠點最早，4

52、號晚1天，5號晚2天，1號出苗最多，4號少一半，5號不出苗。</p><p>　　比較培養(yǎng)基5號與6號，5號用0 12mg/L NAA，6號用0 02mg/L NAA+0 lmg/L IAA．5和6中愈傷組織出現(xiàn)綠點時間一致，6號分化出的綠點比5多，兩者都不出苗。</p><p>　　比較培養(yǎng)基1號、6號和7號，6號多添加了0 lmg/L的IAA，7號多添加了0 2mg/L的IAA 1中愈

53、傷組織出現(xiàn)綠點最早，6號晚1d，7號晚兩天。愈傷組織分化出的綠點個數(shù)1號大于6號大于7號，1號能出苗，6號和7號都不出苗。</p><p>　　根據(jù)以上結(jié)果推測：1號培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素和生長素的比例最為合適，即當(dāng)6-BA濃度為2.0mg/L、NAA為0.02mg/L時，其分化程度最高。</p><p><b>　　4 結(jié)論</b></p><p&

54、gt;　　水稻是人們重要的糧食作物之一，也是經(jīng)典的模式植物．生長和分裂旺盛的胚性愈傷組織細(xì)胞培養(yǎng)是獲得轉(zhuǎn)基因植物的最好來源。近年來，研究者先后從水稻各部位誘導(dǎo)出愈傷組織和再生植株。雖然，幼穗、幼胚、花粉粒、花藥愈傷組織誘導(dǎo)率高，愈傷組織質(zhì)量好而受到青睞，但上述材料多受季節(jié)限制，取材不便，阻礙了水稻組織培養(yǎng)的進(jìn)一步發(fā)展．</p><p>　　本實驗選用本省粳稻種子為材料，對其在不同培養(yǎng)基條件下的出愈率及愈傷組織狀態(tài)

55、進(jìn)行研究，以期獲得狀態(tài)較好的愈傷組織，通過本文研究，可得到如下結(jié)論：對于愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基是NB培養(yǎng)基，并且加入2 mg/L2，4-D和1 mg/L6-BA作為最佳配比激素，即可得到增重率最高的水稻愈傷組織；對于水稻愈傷組織分化的培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基，并且加入2.0mg/L6-BA、0.02mg/LNAA作為最佳比例，其分化水平最高。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)</b><

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