水稻懸浮細胞的包埋脫水法超低溫保存以及多酚誘導的細胞程序性死亡現(xiàn)象.pdf

1、植物胚性懸浮細胞系不僅是全能性原生質(zhì)體的重要來源，而且它本身也可作為植物基因轉(zhuǎn)移的受體。在植物組織培養(yǎng)方面也有較大的應(yīng)用。因此，研究水稻胚性懸浮細胞的保存和長期培養(yǎng)過程中的衰老現(xiàn)象具有十分重要的意義。
　　 本研究通過對包埋脫水法中主要參數(shù)的優(yōu)化，建立了一個能用于水稻胚性懸浮細胞系保存的方法：胚性懸浮細胞依次在遞增濃度為0.25，0.5，0.75和1mol·L-1蔗糖的AA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)預培養(yǎng)2d，在含8％（w/v）海藻酸鈣，

2、1 mol·L-1蔗糖，2 mol·L-1甘油的混合液中包埋，1 mol·L-1蔗糖的AA液體培養(yǎng)基中二次預培養(yǎng)3d，包埋細胞脫水120min，液氮冷凍，細胞解凍和冷凍細胞在含2.5 g·L-1活性炭的AA固體培養(yǎng)基（0.8％瓊脂）恢復培養(yǎng)。細胞恢復培養(yǎng)后，能再產(chǎn)生愈傷組織，但生長變慢，有約5 d的滯后期。該方法不僅可以用于水稻胚性懸浮細胞系的保存，而且可以用于對胚性懸浮細胞系中優(yōu)質(zhì)胚細胞的篩選.首次使用了包埋脫水法成功地保存了水稻懸浮

3、細胞，延長了細胞保存的時間。
　　 在此基礎(chǔ)上，我們研究了水稻胚性懸浮細胞系內(nèi)外源總酚含量與細胞衰老死亡的關(guān)系。在植物體中當細胞受到傷害時，胞內(nèi)本來分隔不會接觸的酚和多酚氧化酶，有機會接觸并在氧氣的作用下，生成醌，導致細胞褐變衰老死亡。我們首次使用酚作為誘導劑，通過外源添加不同濃度的鄰苯二酚處理，模擬生物體內(nèi)酚類物質(zhì)的積累。經(jīng)過不同濃度、時間的處理，我們發(fā)現(xiàn)細胞死亡率呈上升趨勢，內(nèi)源總酚含量增加，H2O2、MDA、含量上升，抗氧

4、化酶被激活。DAPI、AO/EB染色顯示出明顯的細胞凋亡現(xiàn)象，核凝聚，細胞皺縮。分析H2O2、O2、MDA可能是導致細胞死亡的主要原因.我們推測細胞在2mm0ol-5mmol的鄰苯二酚濃度下，細胞發(fā)生程序性死亡。而在10mmol鄰苯二酚處理48h后，細胞死亡較高。而21mmol以下對細胞的傷害較小，耐受力強。細胞之所以沒有立刻褐變死亡，可能是由于細胞有一定的耐受力，這些酶在發(fā)揮作用。酚對其的傷害是一個積累的過程，是隨著時間增加的。這對于