抗苗勒氏管激素對(duì)干細(xì)胞因子負(fù)調(diào)控分子機(jī)制的研究.pdf

1、AMH作為體內(nèi)唯一的抑制始基卵泡生長(zhǎng)的細(xì)胞因子，由顆粒細(xì)胞分泌，從兩個(gè)途徑發(fā)揮其生物學(xué)作用，一方面AMH與顆粒細(xì)胞上特異的Ⅱ型受體(AMHRII)結(jié)合，通過(guò)胞漿內(nèi)一類Smad3中介蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至核內(nèi)，抑制了核內(nèi)CYP19基因mRNA的表達(dá)，降低細(xì)胞色素酶P450的活性而下調(diào)雌激素的分泌，抑制始基卵泡的募集。另一方AMH作為TGF-β家族成員，通過(guò)Smad蛋白影響顆粒細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路中的重要轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而調(diào)控各種細(xì)胞因子的表達(dá)，減弱了這些細(xì)

2、胞因子促進(jìn)細(xì)胞分化、血管生成及延長(zhǎng)細(xì)胞周期的作用。這可能是AMH抑制卵泡募集的主要途徑。但關(guān)于AMH調(diào)控這些細(xì)胞因子進(jìn)而抑制卵泡募集的信號(hào)途徑尚無(wú)報(bào)道，若能突破AMH與卵子之間途徑的研究，掌握AMH調(diào)控此信號(hào)途徑的具體分子機(jī)制，對(duì)于保存和延長(zhǎng)人類生育力將有著深遠(yuǎn)的意義。
　　干細(xì)胞因子(SCF)屬于集落刺激因子(colonystimulatingfactor，CSF)，顆粒細(xì)胞產(chǎn)生的SCF通過(guò)與卵細(xì)胞膜上的自身配體c-kit結(jié)合激

3、活PI3/AKT途徑刺激卵細(xì)胞及卵泡膜細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化以及類固醇激素的產(chǎn)生，從而加速始基卵泡的生長(zhǎng)，因而SCF成為卵巢局部較為重要的生長(zhǎng)因子。目前對(duì)SCF在卵巢局部促進(jìn)作用已證實(shí)，但關(guān)于對(duì)SCF在顆粒細(xì)胞中表達(dá)的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。
　　EricNilsson通過(guò)體外培養(yǎng)大鼠卵巢，發(fā)現(xiàn)AMH可能抑制了SCF促進(jìn)卵子生長(zhǎng)的作用。目前已知AMH和SCF都是顆粒細(xì)胞分泌的，AMH的Ⅱ型受體僅位于顆粒細(xì)胞上，而SCF的受體位于卵細(xì)胞膜，結(jié)合

4、上述研究的結(jié)論，推測(cè)SCF可能是AMH作用于卵子的媒介之一。也提示我們應(yīng)對(duì)AMH與SCF的關(guān)系進(jìn)行進(jìn)一步的研究。目前已證實(shí)AMH則通過(guò)自分泌與旁分泌的方式抑制cAMP中CREB的磷酸化，減少雌激素合成酶的轉(zhuǎn)錄。而SCF啟動(dòng)區(qū)存在cAMP反應(yīng)元件CREB的結(jié)合位點(diǎn)，且cAMP/PKA途徑可增強(qiáng)SCF的轉(zhuǎn)錄。根據(jù)前期研究結(jié)果和上述文獻(xiàn)，我們推測(cè)AMH可能通過(guò)抑制cAMP/PKA途徑減弱SCF的轉(zhuǎn)錄。由此提出研究假設(shè):在顆粒細(xì)胞中AMH通過(guò)抑

5、制cAMP途徑中CREB的磷酸化，減弱SCF啟動(dòng)子活性，下調(diào)SCF基因的轉(zhuǎn)錄，從而減弱SCF促進(jìn)卵子生長(zhǎng)啟動(dòng)的作用，最終抑制卵泡募集。
　　本研究分為三部分，第一章研究行體外受精-胚胎移植(IVF-ET)患者血清、卵泡液、及顆粒細(xì)胞中AMH與SCF蛋白及mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性，第二章采用人黃素化顆粒細(xì)胞原代培養(yǎng)，研究不同濃度的AMH對(duì)SCF分泌的影響，從細(xì)胞水平研究AMH影響顆粒細(xì)胞分泌SCF功能的機(jī)制。第三章采用cAMP激動(dòng)劑

6、或阻斷劑(H89)與rhAMH聯(lián)合、單獨(dú)處理體外培養(yǎng)人黃素化顆粒細(xì)胞，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)半定量檢測(cè)體外培養(yǎng)人黃素化顆粒細(xì)胞SCFmRNA的表達(dá)，從分子水平探討AMH是否通過(guò)抑制cAMP/PKA途徑影響顆粒細(xì)胞SCF分泌過(guò)程。
　　第一章AMH與SCF在血清及卵巢局部表達(dá)相關(guān)性的研究
　　研究對(duì)象:
　　選擇2009年1月-2012年9月期間就診于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心不孕患者共235例，平均年齡32.33±2

7、.46歲，行體外受精體外胚胎移植(IVF-ET)78例，入選研究對(duì)象均測(cè)量其身高，體重，計(jì)算平均體重指數(shù)即體重/身高2(BMI)20.45±1.61，實(shí)驗(yàn)對(duì)象的具體篩選標(biāo)準(zhǔn)為:月經(jīng)周期規(guī)律，經(jīng)超聲監(jiān)測(cè)合并黃體期孕酮水平檢測(cè)證實(shí)排卵功能正常，卵泡刺激素水平在正常范圍（月經(jīng)周期第3天FSH＜15IU/1），無(wú)多囊卵巢綜合征、高泌乳素血癥及子宮內(nèi)膜異位癥，并排除全身其它系統(tǒng)疾病。
　　研究方法:
　　ELISA檢測(cè)不孕癥患者月經(jīng)周

8、期第3天早晨空腹靜脈血清及卵泡液中AMH及SCF蛋白水平;real-timeRT-PCR檢測(cè)人顆粒細(xì)胞AMH及SCFmRNA水平表達(dá)，比較分析二者的相關(guān)性。
　　結(jié)果:
　　235例患者血清中AMH與SCF蛋白水平無(wú)明顯相關(guān)性(r=0.57，P=0.33)。其中78例IVF-ET患者中獲得55例卵泡液及31例顆粒細(xì)胞。55例卵泡液中AMH與SCF蛋白水平有顯著相關(guān)性(r=-0.65;P＜0.05);31例顆粒細(xì)胞中AMH與S

9、CFmRNA有顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.79;P＜0.01)。
　　結(jié)論
　　1.人黃素化顆粒細(xì)胞中AMH與SCFmRNA存在明顯負(fù)相關(guān)性。
　　2.人卵泡液中AMH與SCF蛋白水平呈明顯負(fù)相關(guān)性。
　　3.不同卵巢反應(yīng)患者血清中AMH表達(dá)有差異，SCF表達(dá)無(wú)差異。
　　4.卵巢功能正常患者血清中AMH與SCF蛋白水平無(wú)明顯相關(guān)性。
　　第二章AMH對(duì)體外培養(yǎng)顆粒細(xì)胞分泌SCF的影響
　　研究對(duì)象:

10、
　　人黃素化顆粒細(xì)胞來(lái)自15例因單純男方因素行IVF-ET不孕患者，年齡22-28歲，均選用長(zhǎng)方案超排卵，即在月經(jīng)周期的黃體中期皮下注射長(zhǎng)效達(dá)菲林1.25mg進(jìn)行降調(diào)節(jié)，于月經(jīng)周期第3天應(yīng)用高純度卵泡刺激素(FSH-HP)150-450IU/d進(jìn)行超促排卵，至卵泡直徑至少3個(gè)≥16mm，肌注人絨毛膜促性腺激素hCG10000IU,注射hCG36小時(shí)后在超聲引導(dǎo)下經(jīng)陰道取卵。COV434細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。
　　研究

11、方法:
　　1.人黃素化顆粒細(xì)胞的原代培養(yǎng)，按活細(xì)胞1.0×105個(gè)/ml的密度接種于含10％胎牛血清DMEM培養(yǎng)基的24孔板內(nèi)，培養(yǎng)24小時(shí)后更換無(wú)血清DMEM，按實(shí)驗(yàn)需要分為4組:空白組、AMH10ng/ml組、15ng/ml組、20ng/ml組。
　　2.利用基因克隆、RNA干擾技術(shù)構(gòu)建pGCsi-shRNA-AMH載體并轉(zhuǎn)染COV434細(xì)胞系，經(jīng)鑒定傳染成功后，繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)，real-timeRT-PCR檢測(cè)每組

12、顆粒細(xì)胞SCFmRNA表達(dá)。免疫組化檢測(cè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組顆粒細(xì)胞SCF蛋白。
　　結(jié)果:
　　1.實(shí)驗(yàn)組顆粒細(xì)胞表達(dá)SCFmRNA顯著低于空白對(duì)照組(p＜0.05)，其中20mg/mlrhAMH組顯著減少顆粒細(xì)胞SCFmRNA表達(dá)(p＜0.001)。
　　2.pGCsi-shRNA-AMH載體并轉(zhuǎn)染COV434細(xì)胞系，SCFmRNA及蛋白水平較空白對(duì)照組及陰性組顯著增高(p＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.

13、AMH可降低人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞SCFmRNA及蛋白的表達(dá)，隨AMH濃度的增加抑制作用有增強(qiáng)趨勢(shì)。
　　2.COV434細(xì)胞系經(jīng)干預(yù)AMH基因表達(dá)后，SCFmRNA及蛋白的表達(dá)增多。
　　第三章AMH通過(guò)cAMP/PKA途徑對(duì)人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞SCF表達(dá)調(diào)控
　　實(shí)驗(yàn)對(duì)象:
　　人黃素化顆粒細(xì)胞均來(lái)自于2013年4月至2013年9月美國(guó)東弗吉尼亞醫(yī)學(xué)院Jones生殖醫(yī)學(xué)研究所(TheJonesInstituti

14、onsforReproductiveMedicineinEasternVirginiaMedicalSchool)進(jìn)行體外受精-胚胎移植的患者，共37例。年齡26歲-37歲，不孕因素均為輸卵管因素和男方因素。
　　研究方法:
　　采用不同濃度cAMP(1nM，2nM，3nM，4nM)干預(yù)體外培養(yǎng)顆粒細(xì)胞，篩選出最適濃度;研究在阻斷cAMP/PKA（加入cAMP/PKA抑制劑H89）后AMH對(duì)人卵巢顆粒細(xì)胞SCF分泌的影響。體

15、外培養(yǎng)人黃素化顆粒細(xì)胞分為6組:空白對(duì)照組、AMH20ng/ml組、cAMP3nM組、AMH20ng/ml+cAMP3nM、AMH20ng/ml+H89、cAMP3nM+H89組。采用WesternBlot、real-timeRT-PCR及免疫組化等技術(shù)檢測(cè)體外培養(yǎng)人顆粒細(xì)胞中SCF的mRNA及蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.實(shí)驗(yàn)組顆粒細(xì)胞表達(dá)SCFmRNA顯著高于空白對(duì)照組(p＜0.05），cAMP1nM到3nM組之間有

16、劑量依賴性。cAMP3nM到4nM組比較無(wú)顯著性差異(p＞0.05)。
　　2.rhAMH+cAMP組與cAMP組比較，顆粒細(xì)胞SCFmRNA、蛋白的分泌減少(p＜0.05);與對(duì)照組比較則無(wú)差異(p＞0.05）。AMH可抑制cAMP促進(jìn)人卵巢黃素化顆粒細(xì)胞SCFmRNA及蛋白的表達(dá)。
　　3.cAMP+H89組與cAMP組比較，顆粒細(xì)胞SCFmRNA、蛋白的分泌顯著減少(p＜0.01);與對(duì)照組比較則無(wú)差異(p＞0.05）