HSR對燒傷血清誘導的巨噬細胞TNF-α、HMGB1和IL-10基因表達調(diào)控及其分子機制.pdf

1、第一章燒傷血清誘導的巨噬細胞系RAW264.7釋放TNF-α、HMGB1及IL-10的規(guī)律及意義 目的：從細胞水平探討燒傷血清處理的RAW264.7細胞釋放炎癥介質(zhì)TNF-α、HMGB1、IL-10的規(guī)律及意義。 方法：制備嚴重燒傷大鼠模型獲取燒傷大鼠血清；采用小鼠RAW264.7巨噬細胞，分別以燒傷大鼠血清處理制備細胞模型；細胞隨機分為兩組：(1)正常血清處理組(2)燒傷血清處理組。兩組的劑量效應分別用含有體積分數(shù)0％

2、、5％、10％、20％的正常血清及燒傷血清的培養(yǎng)基與RAW264.7細胞系共培養(yǎng)24h，分別收取燒傷血清刺激組及對照組細胞培養(yǎng)上清，3500 g離心后留取上清于-20℃保存?zhèn)溆?。兩組的時間效應分別以含有體積分數(shù)20％的正常血清及燒傷血清培養(yǎng)基分別培養(yǎng)RAW264.7細胞0h，4h，12h，24h，同上留取離心后的培養(yǎng)液上清。以上每組均設(shè)3個復孔，用雙抗體夾心ELISA法測定RAW264.7培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-10含量，Weste

3、rn blot分析RAW264.7細胞HMGB1的含量。 結(jié)論：燒傷血清能以時間和劑量依賴方式誘導小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7的TNF-α的分泌增加，以時間依賴方式誘導HMGB1和IL-10的分泌增加。 第二章熱休克反應對燒傷大鼠的保護作用及對燒傷血清誘導的巨噬細胞TNF-α，IL-10及HMGBl的影響 目的：探討HSR對燒傷大鼠的保護作用及對燒傷血清誘導的TNF-α、IL-10和HMGB1的影響。

4、 方法：制備燒傷大鼠模型，觀察72h內(nèi)死亡率；傷后6h取各組動物血清觀測各項血清學指標，一部分大鼠于HSR(42℃，15min，室溫下恢復24h)后再進行燒傷，24h后摘取肝、肺組織行病理切片檢查。將傳代RAW264.7細胞隨機分為三組：(1)正常血清處理組。(2)燒傷血清處理組。 (3)熱休克預處理后燒傷血清處理組：熱休克(HSR)處理：將細胞置于42℃的水浴箱中熱休克1 h，然后在37℃恢復12 h，然后加入燒傷血清處理。三組的劑

5、量效應分別用含有體積分數(shù)0％、5％、10％、20％的正常血清及燒傷血清的培養(yǎng)基與小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7共培養(yǎng)24h，分別收取燒傷血清刺激組及對照組細胞培養(yǎng)上清，3500 g離心后留取上清備用。三組的時間效應分別以含有體積分數(shù)20％的正常血清及燒傷血清的培養(yǎng)基分別培養(yǎng)RAW264.7細胞0 h，4 h，12 h，24h，同上留取離心后的培養(yǎng)液上清，以上每組均設(shè)3個復孔。用雙抗體夾心ELISA法測定RAW264.7培養(yǎng)上清中TN

6、F-α和IL-10含量，Western blot分析HMGB1的含量，RT-PCR檢測TNF-α mRNA的表達、IL-10 mRNA的表達。 結(jié)論：HSR抑制燒傷血清誘導的RAW264.7細胞HMGB1釋放和TNF-α mRNA的表達；HSR上調(diào)燒傷血清誘導的RAW264.7細胞IL-10mRNA的表達。 第三章 HSF1過表達對RAW264.7巨噬細胞TNF-a，IL-10及HMGB1基因表達的影響 目的：探

7、討熱休克因子1(heat shock factor1，HSF1)過表達對燒傷血清處理的巨噬細胞炎癥介質(zhì)TNF-α、高遷移率族蛋白-1(HMGB1)、IL-10基因表達的影響。 方法：制備嚴重燒傷大鼠模型，獲取燒傷大鼠血清；構(gòu)建HSF1基因的真核表達載體，繼而將HSF1真核表達載體轉(zhuǎn)染RAW264.7巨噬細胞，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HSF1的巨噬細胞株，最后將轉(zhuǎn)基因細胞經(jīng)燒傷血清處理，探討HSF1過表達對燒傷血清處理的RAW264.7巨噬細

8、胞TNF-a，HMGB1和IL-10基因表達的影響。 結(jié)論：HSF1過表達可以抑制燒傷血清誘導的RAW264.7巨噬細胞TNF-a mRNA和HMGBlmRNA的表達，同時上調(diào)IL-10 mRNA的表達。 第四章 HSF1對IL-10的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究 目的：探討HSF1對IL-10的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。 方法：合成IL-10基因啟動子區(qū)含HSE位點的寡核苷酸探針進行凝膠滯留實驗(EMSA)，分析HSF1與IL-1