2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、近些年來,科研工作者致力于更多的消去化修飾的多肽和蛋白新成員的發(fā)現(xiàn),從而更好的解釋各種各樣的生命現(xiàn)象,填補這一領域的空白,但一直苦于沒有較好的研究方法。組蛋白的消去化修飾位點的鑒定亦是如此。
  不飽和氨基酸能夠通過巰基進攻發(fā)生米歇爾共價加成,對于含有消去化修飾的蛋白和多肽的鑒定,可以通過利用巰基試劑化學標記,最終親和富集得到特異性的消去化修飾的蛋白或者多肽。
  分析五種組蛋白(H1、H2A、H2B、H3、H4)的氨基酸組

2、成,發(fā)現(xiàn)五種組蛋白中易發(fā)生消去化修飾的絲氨酸和蘇氨酸都占有很高的比例,說明組蛋白中很有可能含有很多消去化修飾位點。而且除了H3含有一個半胱氨酸外,其他四種組蛋白都不含有半胱氨酸。組蛋白氨基酸組成上的特殊性,不僅為實驗方法的可行性提供了可靠的依據(jù),還為后期巰基純化過程中非特異性的去除提供了方便。對于組蛋白消去化修飾位點的鑒定,就可以選用二硫蘇糖醇(DTT)這種含有雙巰基的小分子試劑和組蛋白進行共價加成。其中,一個巰基和打開消去化修飾的不飽

3、和氨基酸,使得組蛋白帶上DDT標簽;另一個暴露出來的巰基和巰基活化的瓊脂糖凝膠柱親和性的結合,最終純化出特異性結合的目標蛋白。
  首先利用選取牛腦組織,反復洗滌細胞核,通過酸提和高鹽提取的方式得到組蛋白。選取酸提的組蛋白優(yōu)化了加成反應的最佳條件。
  通過去垢劑性質(zhì)和小分子去除所需條件的比較,選取了甘油這種分子量較小、容易通過透析除去的去垢劑。接著,優(yōu)化出了甘油在加成反應中最佳的反應濃度為8%。然后,比較了幾種常見緩沖液的

4、加成反應的強弱,結果顯示幾種緩沖液都有比較強的反應信號,其中碳酸氫鈉最強。最后,比較了幾種溫度在加成反應信號的強弱,結果顯示,25℃為最適反應溫度。然后,優(yōu)化了親和富集組蛋白的最優(yōu)純化條件。
  比較不同溫度下標記的組蛋白掛柱效率的結果顯示:室溫孵育有較強的掛柱效率。比較在不同緩沖液中DTT化學標記的組蛋白親和富集得到的組蛋白,結果顯示:組蛋白在Tris,NaHCO3中都有較強的掛柱效率,HEPES和NaHCO3都能夠純化到特異性

5、較強的組蛋白。最后,將純化過的組蛋進行preclean,選取高濃度的尿素去除非特異結合的蛋白,最終得到了特異性結合的組蛋白。
  總之,本課題是建立在實驗室已經(jīng)成熟的標記探針的基礎上,檢測了最佳的反應條件,分別從緩沖液、去垢劑、反應時間和溫度等方面進行了優(yōu)化,選擇了最適的反應條件進行化學標記,之后通過半胱氨酸標準曲線檢測到標記樣品巰基自由基含量的增加,之后通過巰基活化的瓊脂糖柱子特異性的純化出了目標蛋白。發(fā)現(xiàn)五種組蛋白都有特異性的

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