肝纖維化發(fā)生機(jī)制中組蛋白修飾變化及意義的研究.pdf

1、目的：組蛋白修飾是表觀遺傳調(diào)控中的重要內(nèi)容，組蛋白修飾異常與許多疾病發(fā)生發(fā)展有關(guān)。有關(guān)肝纖維化病理改變中組蛋白修飾的作用目前還不清楚，為此，本研究觀察在四氯化碳（CCl4）致大鼠肝纖維化后大鼠肝組織中組蛋白修飾的變化及大鼠原代肝星狀細(xì)胞（HSCs）自發(fā)活化中組蛋白修飾的改變，探討組蛋白修飾變化在肝纖維化發(fā)生機(jī)制中的變化及可能的作用。
　　方法:
　?。?）雄性Wistar大鼠20只，180 g～200 g，隨機(jī)分為正常對(duì)照組

2、和肝纖維化組。肝纖維化組用40％CCl4植物油溶液0.3ml/100g皮下注射，間隔三天注射一次以制備大鼠肝纖維化模型，正常組大鼠皮下注射等量植物油溶液。實(shí)驗(yàn)8周末殺鼠，取兩組大鼠肝臟，測(cè)定肝臟指數(shù)；取肝組織常規(guī)固定，HE染色、Masson染色觀察組織病理改變及膠原纖維沉積情況；western blot檢測(cè)并比較兩組大鼠肝臟組織α-SMA、Ⅰ型膠原表達(dá)情況以及acH4K12、acH3K9、H3K4me2和H3K9me2修飾水平變化。

3、r>　?。?）膠原酶循環(huán)灌注結(jié)合密度梯度離心的方法分離大鼠HSCs，細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)desmin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)以鑒定HSCs,光鏡觀察HSCs自發(fā)活化過(guò)程中形態(tài)變化、western blot檢測(cè)HSCs自發(fā)活化過(guò)程中α-SMA、desmin的表達(dá)，確定HSCs活化；以western blot分別檢測(cè)比較靜止型HSCs和激活型HSCs中acH4K12、acH3K9、H3K4me2和H3K9me2修飾水平變化。
　　結(jié)果：
　　(

4、1)40%CCl4植物油溶液0.3ml/100g皮下注射8周后，注射組大鼠肝臟指數(shù)明顯高于正常組大鼠肝臟指數(shù)（5.98±0.69/3.81±0.17，P<0.01）；病理學(xué)檢查提示注射組大鼠肝組織內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝臟纖維結(jié)締組織明顯增多，部分區(qū)域有假小葉形成，根據(jù)王寶恩肝纖維化分級(jí)發(fā)現(xiàn)注射組大鼠肝纖維化程度明顯高于對(duì)照組大鼠，提示40%CCl4植物油溶液0.3ml/100g皮下注射8周后，注射組大鼠肝纖維化形成。肝纖維化標(biāo)志物檢測(cè)發(fā)

5、現(xiàn)注射組大鼠肝臟中α-SMA、Ⅰ型膠原表達(dá)明顯較正常組高（P<0.01），這些結(jié)果表明大鼠肝纖維化模型復(fù)制成功。
　　(2)以western blot檢測(cè)并比較兩組大鼠肝臟組織中acH4K12、acH3K9、H3K4me2和H3K9me2修飾水平發(fā)現(xiàn)，與正常組大鼠相比，肝纖維化組大鼠肝組織中acH4K12修飾水平減少（1.11±0.19/0.55±0.27，P<0.01），acH3K9、H3K9me2修飾水平明顯增加（0.379±

6、0.01/2±0.20，P<0.01；0.277±0.03/1.6±0.23，P<0.01），H3K4me2修飾水平有所增加但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.456±0.12/0.586±0.24，P>0.05）。
　　（3）用膠原酶循環(huán)灌注結(jié)合密度梯度離心法提取大鼠原代HSCs培養(yǎng)24h后，免疫熒光檢測(cè)HSCs中desmin表達(dá)，發(fā)現(xiàn)desmin陽(yáng)性的細(xì)胞大于90%，提示細(xì)胞純度大于90%。光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，剛分離的HSCs呈折光性很強(qiáng)的圓

7、球形，培養(yǎng)6h后細(xì)胞基本貼壁，胞質(zhì)內(nèi)含大量折光性強(qiáng)的顆粒；培養(yǎng)24h后HSCs開(kāi)始伸出偽足，培養(yǎng)4～5d后HSCs細(xì)胞繼續(xù)伸展，形態(tài)逐漸變成梭形，融合成片，胞質(zhì)內(nèi)折光性強(qiáng)的顆粒逐漸減少；培養(yǎng)第10～15d時(shí)，絕大多數(shù)細(xì)胞呈典型星形，融合成片，細(xì)胞內(nèi)折光性顆粒消失。
　?。?）進(jìn)一步用western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，分離培養(yǎng)24h的HSCs表達(dá)desmin，但幾乎不表達(dá)α-SMA；隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，4～5d后HSCs內(nèi)desm

8、in表達(dá)開(kāi)始逐漸增加而α-SMA表達(dá)逐步增加，至培養(yǎng)15d時(shí)HSCs內(nèi)α-SMA表達(dá)水平達(dá)到峰值，提示培養(yǎng)15天HSCs完全活化。根據(jù)HSCs細(xì)胞形態(tài)變化及HSCs活化標(biāo)志蛋白檢測(cè)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)初步確定培養(yǎng)24h HSCs為靜止型HSCs,培養(yǎng)15d HSCs為激活型HSCs。
　?。?）western blot檢測(cè)靜止型和激活型HSCs中acH4K12、acH3K9、H3K4me2和H3K9me2修飾水平，結(jié)果顯示：與靜止型HSC

9、s比較，acH4K12、acH3K9、H3K9me2修飾水平明顯降低（0.162±0.012/0.035±0.010，P<0.01；0.430±0.056/0.235±0.024，P<0.01；0.159±0.007/0.036±0.007，P<0.01），其中acH4K12修飾水平變化與肝纖維化大鼠肝組織檢測(cè)結(jié)果一致，而acH3K9、H3K9me2修飾水平則與體內(nèi)結(jié)果相反；與肝纖維化組大鼠肝組織中H3K4me2表達(dá)有所增加，但差異無(wú)顯

10、著性意義不同，H3K4me2修飾水平在激活型HSCs中較靜止型HSCs明顯增加（0.155±0.012/0.289±0.007，P<0.01），且與α-SMA表達(dá)逐漸增加的變化趨勢(shì)一致。
　　結(jié)論：我們的研究表明，肝纖維化大鼠肝組織acH4K12修飾水平減少，acH3K9、H3K9me2修飾水平明顯增加，提示acH4K12、acH3K9、H3K9me2修飾水平改變可能參與了大鼠肝纖維化發(fā)生機(jī)制，推測(cè)肝纖維化發(fā)生中肝臟組蛋白修飾的改