鱉甲抗肝纖維化活性肽的合成及結(jié)構(gòu)修飾研究.pdf

1、鱉甲(Trionyx sinensis carapace)為藥食兩用傳統(tǒng)中藥,收載于歷年版《中國藥典》,具有滋陰潛陽、軟堅散結(jié)、退熱除蒸的功效。鱉甲為中醫(yī)臨床治療肝纖維化疾患的常用中藥,以鱉甲為君藥的多種中藥復(fù)方制劑,如鱉甲軟肝片、鱉甲抗纖方、鱉甲煎丸等用于肝纖維化疾患,療效較好。本實驗室前期研究表明,鱉甲的水煎煮液對肝纖維化大鼠模型具有較好的治療作用;并首次從鱉甲水提物中分離和篩選出了三種抗肝纖維化活性肽類化合物,經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定分別為A:

2、H-G-R-F-G(572.3)、B:N-P-N-P-T(542.16)、C:N-D-D-Y(526.2)。
　　 本論文在實驗室前期研究基礎(chǔ)上,以鱉甲中分離鑒定的三種活性肽成分A、B、C為先導(dǎo)化合物,采用Fmoc固相合成方法,得到了三種合成肽,其純度達(dá)98％以上;經(jīng)高分辨率質(zhì)譜儀鑒定其分子量與理論值一致,且其裂解的碎片離子序列與先導(dǎo)化合物一致;以肝星狀細(xì)胞藥理模型為受試對象,采用MTS比色法和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)對三種

3、合成肽進(jìn)行活性篩選,結(jié)果顯示合成肽A(H-G-R-F-G)、B(N-P-N-P-T)具有較強(qiáng)的抗肝纖維化作用。
　　 采用免疫印跡法(Western-blot)和Annexin V-FITC/PI法,探討了合成肽A(H-G-R-F-G)和B(N-P-N-P-T)對ColⅠ、ColⅢ、Smad3、p-Smad3、α-SMA、TIMP-1和MMP-1蛋白表達(dá)的影響和對肝星狀細(xì)胞(HSC)凋亡的影響。研究結(jié)果表明,合成肽A和B通過以下

4、三種途徑發(fā)揮抗肝纖維化藥效作用:①使TGF-β1刺激的肝星狀細(xì)胞ColⅠ、ColⅢ及α-SMA蛋白的表達(dá)明顯下調(diào),減少其ColⅠ、ColⅢ的合成與分泌;②使TGF-β1刺激的p-Smad3蛋白表達(dá)顯著減少,從而減少Smad3蛋白磷酸化和ECM基因轉(zhuǎn)錄;③使TGF-β1刺激的肝星狀細(xì)胞TMP-1的表達(dá)明顯降低,而MMP-1的表達(dá)升高,從而增強(qiáng)MMP-1的活性和降低TMP-1的作用,促進(jìn)ECM的降解。上述研究結(jié)果闡釋了化學(xué)合成的鱉甲活性肽A

5、和B的抗肝纖維化作用機(jī)理。
　　 針對小分子合成肽在體內(nèi)存在免疫原性、作用時間短及穩(wěn)定性差等問題,對合成肽A進(jìn)行了化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾研究。采用Fmoc固相合成方法,以非天然D型氨基酸替換合成肽A結(jié)構(gòu)中對應(yīng)的L型氨基酸,得到七種肽的結(jié)構(gòu)修飾產(chǎn)物,并對七種結(jié)構(gòu)修飾產(chǎn)物在不同溫度、不同緩沖液種類及不同pH環(huán)境進(jìn)行穩(wěn)定性考察,研究結(jié)果表明,與合成肽A比較,其穩(wěn)定性均明顯增強(qiáng);采用CCK-8比色法,對化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾產(chǎn)物進(jìn)行了抗肝纖維化篩選研究,結(jié)