腫瘤來(lái)源的非對(duì)稱(chēng)IgG對(duì)巨噬細(xì)胞功能的影響.pdf

1、背景和目的：
　　隨著對(duì)免疫球蛋白G（IgG）研究的深入，許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)IgG并非僅由成熟的B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，在一些非B淋巴細(xì)胞中如癌細(xì)胞、神經(jīng)元和免疫豁免器官（如眼睛和精子等）的上皮細(xì)胞可以產(chǎn)生IgG，并發(fā)現(xiàn)這些非B細(xì)胞來(lái)源的IgG發(fā)揮著一些特殊的作用，如促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。Margni等學(xué)者利用Con A分離法從血液中提純出一種特殊的IgG，這種IgG具有異常的糖基化結(jié)構(gòu)，使得IgG原有的對(duì)稱(chēng)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，于是命名為非對(duì)

2、稱(chēng)IgG。這種非對(duì)稱(chēng)的IgG在與抗原結(jié)合后不能引起下游的補(bǔ)體活化、ADCC、調(diào)理作用等免疫效應(yīng)。據(jù)報(bào)道,體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞能夠通過(guò)甘露糖受體與糖基化的 IgG結(jié)合。還有報(bào)道稱(chēng)，糖基化的免疫球蛋白 G能夠與腎小球腎炎新月體中的巨噬細(xì)胞上的甘露糖受體反應(yīng)。本研究的目的在于研究腫瘤來(lái)源的非對(duì)稱(chēng)IgG對(duì)巨噬細(xì)胞的功能有怎樣的影響，并且在腫瘤免疫逃逸過(guò)程中是否發(fā)揮重要的作用。
　　材料與方法：
　　1．材料通過(guò)汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)

3、院醫(yī)學(xué)倫理審核，血液標(biāo)本采集汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系在讀的健康男性大學(xué)生，平均年齡25歲。腫瘤組織標(biāo)本取自汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院病理科，標(biāo)本量20例。
　　2．組織總IgG提取離心后的腫瘤組織勻漿后提取的總蛋白用裝有rProtein G的親和層析柱純化，與層析柱結(jié)合的蛋白質(zhì)即為總IgG。
　　3．分離對(duì)稱(chēng)、非對(duì)稱(chēng)IgG利用Con A Sepharose4B層析柱，將純化的IgG加入層析柱，層析柱上的Con A可與高甘露糖

4、型IgG結(jié)合，未結(jié)合的IgG即為對(duì)稱(chēng)IgG。
　　4．銀染將提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE膠分離，再進(jìn)行硝酸銀染色技術(shù)，以檢測(cè)目的蛋白的純度。
　　5．生物素標(biāo)記 IgG用biotin標(biāo)記試劑盒將蛋白質(zhì)標(biāo)記上生物素，作為免疫細(xì)胞化學(xué)染色的一抗。
　　6.免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)巨噬細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)以及非對(duì)稱(chēng)IgG與巨噬細(xì)胞的反應(yīng)。
　　7．巨噬細(xì)胞的分化和極化從外周血中分離外周血單個(gè)核細(xì)胞,然后用GM-CSF和M-CS

5、F刺激單核細(xì)胞分化,再用IFN-γ加LPS以及IL-4分別極化巨噬細(xì)胞。
　　8.細(xì)胞增殖活性檢測(cè)用細(xì)胞增殖試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性。
　　9．甘露糖受體封閉實(shí)驗(yàn)先用D-甘露糖與巨噬細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2個(gè)小時(shí)，然后加入非對(duì)稱(chēng)IgG刺激細(xì)胞。檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性。
　　10．抗體預(yù)吸收實(shí)驗(yàn)先讓非對(duì)稱(chēng) IgG與甘露糖受體在37℃孵育2個(gè)小時(shí)，然后再作用于細(xì)胞。檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性。
　　11．Real-time PC

6、R技術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞炎性因子和相關(guān)蛋白的mRNA的表達(dá)。
　　12．蛋白芯片技術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞分泌的炎性因子和趨化因子的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1．腫瘤來(lái)源的非對(duì)稱(chēng)IgG的糖基位于重鏈的Fab段。
　　2．M1巨噬細(xì)胞主要呈矮胖的圓形，有CD68、CD206、iNOS的表達(dá)；M2巨噬細(xì)胞主要呈長(zhǎng)瘦的梭型，有CD68、CD206、CD163的表達(dá)。
　　3.非對(duì)稱(chēng)IgG能夠與巨噬細(xì)胞反應(yīng)，而對(duì)稱(chēng)IgG不能。

7、>　　4．非對(duì)稱(chēng)IgG能夠抑制M1巨噬細(xì)胞的增殖活性，促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞的增殖活性。
　　5．經(jīng)D-甘露糖封閉后，非對(duì)稱(chēng)IgG失去了對(duì)巨噬細(xì)胞的增殖活性的效應(yīng)。
　　6．經(jīng)MR預(yù)吸收后，非對(duì)稱(chēng)IgG失去了對(duì)巨噬細(xì)胞的增殖活性的效應(yīng)。
　　7．非對(duì)稱(chēng)IgG能夠降低M1相關(guān)的mRNA的表達(dá)，同時(shí)增加M2相關(guān)的mRNA的表達(dá)。
　　8．非對(duì)稱(chēng) IgG能夠促進(jìn) IL-2、IL-4、IL-10、IL-15、MIP-1α的表達(dá)

8、。同時(shí)，能夠抑制TNF-α、IL-6、IL-8、IL-12、TIMP-1、Eotaxin-2的表達(dá)。
　　9．經(jīng)過(guò)非對(duì)稱(chēng)IgG刺激后的巨噬細(xì)胞上清液能夠促進(jìn)Hela細(xì)胞的增殖。
　　結(jié)論：
　　腫瘤來(lái)源的非對(duì)稱(chēng)IgG能夠與巨噬細(xì)胞反應(yīng)，從而影響巨噬細(xì)胞的增殖活性、mRNA表達(dá)以及炎性因子的分泌。此外，經(jīng)過(guò)非對(duì)稱(chēng)IgG刺激后的巨噬細(xì)胞上清液能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。這說(shuō)明腫瘤來(lái)源的非對(duì)稱(chēng)IgG可能在腫瘤免疫逃逸過(guò)程中發(fā)揮重