缺氧對腫瘤相關巨噬細胞生物學特征的影響.pdf

1、目的：
　　 通過使用氟波脂（Phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA）、重組人白細胞介素4( Recombinant Human Interleukin-4，IL-4)刺激人單核白血病THP-1細胞株，獲得M2型巨噬細胞。然后分別在缺氧和常氧條件下，對M2型巨噬細胞和人結腸癌HCT-116細胞進行共培養(yǎng)。觀察缺氧對腫瘤相關巨噬細胞自噬及細胞因子表達的影響。
　　 方法：
　　 1．

2、用PMA刺激誘導人單核白血病THP-1細胞分化為巨噬細胞，再通過IL-4刺激巨噬細胞分化為M2型巨噬細胞。2．構建transwell非接觸共培養(yǎng)體系，分別在常氧和缺氧條件下對M2型巨噬細胞單獨培養(yǎng)及與HCT-116細胞進行共培養(yǎng)24h、48h。3．實驗分組：將M2型巨噬細胞常氧條件單獨培養(yǎng)24h、48h兩組作為對照組，再設缺氧單獨培養(yǎng)24h、48h，常氧共培養(yǎng)24h、48h及缺氧共培養(yǎng)24h、48h共計六個實驗組。4．分別收集不同培養(yǎng)條

3、件和不同培養(yǎng)時間的M2型巨噬細胞，提取蛋白，western-blot檢測各組標本中的自噬特異性蛋白beclin-1和微管相關蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein1 light chain3,LC-3）的表達。收集各組細胞培養(yǎng)上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測上清液中的白細胞介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）、白細胞介素（Interleukin-12，IL-12）、腫瘤壞死因子α(Tu

4、mor necrotic factor-α，TNF-α)的表達。
　　 結果：
　　 1．成功誘導THP-1細胞分化為M2型巨噬細胞，經(jīng)流式細胞儀檢測細胞CD68分子表達率為86.35％。2．酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunoabsorbentassay，ELISA)檢測IL-1β實驗各組中常氧共培養(yǎng)組(24h、48h)、缺氧單獨培養(yǎng)組(24h、48h)與對照組(24h、48h)差異無統(tǒng)計學意義(

5、P＞0.05)，缺氧共培養(yǎng)組24h:0.7900±2.65%,48h：0.7433±4.16%分別與對照組24h:0.8717±5.11%,48h：0.8733±3.21%比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，缺氧共培養(yǎng)組24h、48h IL-1β表達均下調。實驗組各組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。IL-12和TNF-α的實驗各組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。IL-12和TNF-α表達在缺氧及共培養(yǎng)作用下無明顯變化。

6、　　 通過測量LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的灰度值比值，常氧各組之間無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。缺氧各組LC3Ⅱ／LC3Ⅰ的比值：缺氧單獨培養(yǎng)24h、48h，缺氧共培養(yǎng)24h、48h分別為0.3714±5.49%、1.0706±8.00%、0.4203±5.07%、1.1377±6.18與對照組24h、48h的比值0.2590±0.78%、0.2617±0.82%比較差異顯著，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)并與缺氧時間正相關。Beclin1蛋白

7、表達在常氧各組內參灰度值比值差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。缺氧各組Beclin1表達相對值即Beclin1/β-actin的灰度值比值：缺氧單獨培養(yǎng)24h、48h，缺氧共培養(yǎng)24h、48h分別為0.4385±2.04%、0.6451±3.96%、0.6871±2.21%、8235±7.70%與對照組24h、48h的灰度值比值0.2876±0.67%、0.2856±1.420比較差異顯著，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，差異與缺氧時間正