腫瘤相關抗原CHP2對卵巢癌細胞生物學行為的影響.pdf

1、[研究背景和目的]：卵巢癌是女性生殖器官常見的腫瘤之一，但其發(fā)病機制還不十分明確，腫瘤特異/相關抗原的鑒定、分離及其生物學功能的探討是當前腫瘤研究的熱點方向之一。CHP2(Calcineurin homologous protein 2)是最近從肝細胞性肝癌中篩選出的腫瘤相關抗原，可表達于某些腫瘤如肝癌、結腸癌、宮頸癌及白血病等組織細胞，而在相應的正常組織或細胞中沒有檢測到表達，其生物學功能目前尚不清楚。本研究旨在探討CHP2在卵巢癌細

2、胞中的表達狀況及其對卵巢癌細胞生物學行為的影響。 [方法]： 1、CHP2在卵巢癌組織中的表達：應用RT-PCR法測定20例正常人卵巢組織和20例卵巢上皮癌組織中CHP2 mRNA的表達。 2、質粒構建與轉染：構建pEGFP-N1-CHP2表達載體，并通過脂質體介導的基因轉染方法，將此質粒轉染入OVCAR3細胞中，并篩選出穩(wěn)定克隆。實驗分為3組，CHP2基因轉染組(OVCAR3/CHP2組)、空載體轉染組(OVC

3、AR3/Neo組)和空白對照組(OVCAR3組)。 3、CHP2和Na+/H+exchanger isoform 1(NHE1)在OVCAR3細胞中表達的鑒定：利用RT-PCR技術檢測OVCAR3細胞中CHP2和NHE1轉錄水平的表達。用熒光顯微鏡下觀察的方法檢測3組細胞中CHP2綠色熒光融合蛋白水平的表達。 4、細胞增殖實驗：將處于對數(shù)生長期的OVCAR3/CHP2、OVCAR3/neo和OVCAR3以相同數(shù)量接種后應

4、用細胞活力儀每隔12小時對活細胞進行計數(shù)繪制生長曲線。 5、粘附實驗：與上述相同辦法分組及制備細胞，分別于15 min、30 min 60 min，或90min．用細胞活力儀分別計數(shù)上清中和貼附的細胞數(shù)，計算細胞粘附率。 6、劃痕實驗：將細胞以相同數(shù)量接種于預先包被有FN (Fibronectin)的6孔培養(yǎng)板上，單層細胞表面劃出一條橫行無細胞刮除帶，相差顯微鏡下照相(10倍)并測量劃痕的寬度(Oh)，36小時后，以相同

5、的方法照相、測量。將0h劃痕兩端的距離設為100﹪，計算各組細胞在培養(yǎng)36h后的劃痕區(qū)域占0h劃痕區(qū)域的百分比。 7、侵襲實驗：采用Transwcll小室體外侵襲實驗檢測CHP2基因轉染前后穿透人工重組基底膜的能力。將細胞以相同數(shù)量接種于包被有Matrigel基質膠的小室上室，下室加入無血清的鼠成纖維細胞NIH3T3上清培養(yǎng)液。培養(yǎng)12 h，40倍鏡下隨機取10個視野計數(shù)穿膜的細胞數(shù)。 8、統(tǒng)計學方法：統(tǒng)計分析利用SPSS11.

6、5軟件包，CHP2在卵巢癌組織中的表達的統(tǒng)計學處理用，檢驗，p<0.05被認為有統(tǒng)計學意義。其余實驗應用單因素方差分析(ANOVA)配合q檢驗(Newman-Keuls)進行比較，p<0.05被認為有統(tǒng)計學意義。 [結果] 1、CHP2：在卵巢癌組織中的表達：20例卵巢癌組織CHP2 mRNA陽性表達17例，而在20例正常卵巢組織中僅1例表達陽性。CHP2在卵巢癌組織的表達率顯著增高(<'2>=25.86，p<0.05)

7、。 2、質粒構建與轉染：成功構建了CHP2基因真核表達載體并建立了穩(wěn)定表達CHP2的細胞株OVCAR3/CHP2。 3、CHP2和NHEl在OVCAR3細胞中表達的鑒定：在未轉染和空載體轉染的OVCAR3細胞中沒有檢測到CHP2的表達，在pEGFP-N1-CHP2表達載體轉染后OVCAR3細胞中有CHP2的高表達。在OVCAR3細胞中有NHEl的強表達，而且在轉染前后沒有改變。熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)EGFP/CHP2融合蛋

8、白主要表達于胞漿近膜區(qū)，而在空質粒轉染組EGFP則廣泛表達于整個細胞。 4、細胞增殖實驗、粘附實驗、劃痕實驗及侵襲實驗：OVCAR3/CHP2組細胞的生長速度較OVCAR3/Neo和OVCAR3組增快(p<0.05)，粘附能力也較后兩組增強(P<0.05)。OVCAR3/CHP2組細胞在劃痕實驗中的遷移能力和在侵襲實驗中穿過人工基底膜的侵襲能力均較OVCAR3/Neo和OVCAR3組明顯增強，分別具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)。