SARS-CoV S DNA疫苗誘導的記憶性T細胞及S蛋白T細胞表位的研究.pdf

1、嚴重急性呼吸綜合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)，又稱傳染性非典型肺炎，是一種新出現(xiàn)的傳染性疾病。2003年4月16日，WHO正式宣布引起SARS的病原體是一種全新的冠狀病毒，并命名為SARS冠狀病毒(SARScoronavirus，SARS-CoV)。研究發(fā)現(xiàn)，SARS-Cov包含四種主要的結(jié)構(gòu)蛋白，分別為S蛋白、M蛋白、N蛋白及E蛋白。其中，S蛋白主要與易感細胞表面受體結(jié)合，誘導病毒

2、包膜與靶細胞膜間的融合，而且其基因序列相對保守，是SARS疫苗研發(fā)的理想靶標。目前正在研制的SARS疫苗包括：滅活疫苗、核酸疫苗及蛋白疫苗等類型。其中，以SARS-CoV S蛋白為基礎(chǔ)的核酸疫苗是目前研究的熱點。 研究表明SARS病毒感染機體或者疫苗免疫以后，可以誘導中和抗體產(chǎn)生，體液免疫應(yīng)答在機體抗SARS病毒感染中發(fā)揮重要作用。但是，SARS病毒感染或者疫苗免疫是否也能同時誘導細胞免疫應(yīng)答的產(chǎn)生，參與細胞免疫反應(yīng)的細胞亞群的

3、表型特征如何，細胞免疫在體內(nèi)能否長期維持等問題仍然不清楚。在文章的第一章，我們發(fā)現(xiàn)使用SARS-Cov S DNA疫苗免疫小鼠可以同時誘導細胞和體液免疫應(yīng)答，并且使用SARS-CoV S DNA疫苗加強免疫可以提高抗原特異性細胞免疫應(yīng)答的強度。其次，根據(jù)IFN-γ和IL-2的表達情況，CD4<'+>T抗原特異性T細胞可分為3個明顯亞群：IFN-γ<'->IL-2<'+>，IFN-γ<'+>IL-2<'+>和IFN-γ<'+>IL-2<'

4、->；而CD8<'+>T細胞只存在2個明顯亞群：IFN-γ<'+>IL-2<'+>和IFN-γ<'+>IL-2<'->。此外，sARS-covs DNA疫苗經(jīng)肌肉免疫以后，誘導的抗原特異性IFN-γ<,'+>細胞以CD8<'+>T細胞為主，且多分布在非淋巴器官(如肺)；而經(jīng)皮下免疫以后，誘導的抗原特異性IFN-γ<,'+>細胞以CD4<'+>T細胞為主，主要分布在局部淋巴結(jié)。最后，我們發(fā)現(xiàn)使用SARS-CoVs DNA疫苗誘導的抗原特異

5、性IFN-γ<,'+>和IL-2<,+>T細胞都不表達CD62L，而幾乎所有的表達IL-2的CD4<"+>和CD8<'+>T細胞均表達CD127，屬于記憶性細胞。大部分(60-75﹪)的CD8<'+>IFN-γ<,'+>T細胞都不表達CD127，屬于效應(yīng)性T細胞。文獻報道，以SARS—CoV S蛋白或者S蛋白的受體結(jié)合區(qū)(RBD)為基礎(chǔ)的疫苗，在誘導機體產(chǎn)生保護性免疫應(yīng)答的同時，會引起肺部的損傷。而多肽疫苗能夠在誘導有效的體液和細胞免疫

6、應(yīng)答的同時盡量減少蛋白疫苗誘導的免疫病理作用。在文章的第二章，我們圍繞著SARS-CoV S蛋白T細胞表位肽的篩選，表位肽免疫原性的檢測等方面展開實驗。我們使用部分氨基酸重疊的SARS-CoV S多肽庫，最終篩選出四條H-2<'d>限制性表位肽：N50、N60、P141和P152。其中，N50和P141特異性的作用于CD8<+>T細胞，N60和P152特異性作用于CD4<'+>T細胞。N50和N60位于RBD，且分別誘導CD4<'+>和

7、CD8<'+>細胞產(chǎn)生IFN-γ，的作用強于P141和P152，屬于優(yōu)勢表位。同時，我們發(fā)現(xiàn)N50不能誘導SARS-CoV S DNA疫苗免疫的C57BL/6小鼠的脾細胞產(chǎn)生IFN-γ，而N60卻能誘導C57BL/6小鼠的CD8<'+>T細胞產(chǎn)生IFN-γ。此外，我們發(fā)現(xiàn)N50和N60能夠有效的刺激記憶性T細胞分泌IFN-γ。而且使用N50和N60與佐劑CpG加強免疫小鼠，能夠明顯的提高體內(nèi)IFN-γ<'+>和/或IL-2<'+>抗原特

8、異性細胞的含量。 細胞毒性T細胞表位(CTL epitope)是蛋白抗原經(jīng)抗原遞呈細胞(Antigenprocess cell，APC)加工處理，繼而與MHC I類分子結(jié)合并最終提呈給T細胞受體(TCR)識別，引起有效免疫應(yīng)答的短肽。在文章的第二章，我們發(fā)現(xiàn)N50(S365-374)能誘導SARS-CoV S DNA疫苗免疫：BALB/c小鼠脾細胞中的CD8<'+>T細胞分泌IFN-γ，含有CTL表位。然而，在這個CTL表位中，

9、哪些位點是決定其功能的主要位點?在文章的第三章中，我們合成不同長度的N50片段并分別使用酸堿性不同的丙氨酸(A)、賴氨酸(K)和天冬氨酸(D)對N50(S365-374，KCYGVSATKL)上的殘基進行單個氨基酸置換，觀察突變多肽刺激抗原特異性細胞產(chǎn)生IFN-γ能力。結(jié)果表明去掉N50“N”端首位氨基酸“K”，或者使用不同性質(zhì)的氨基酸對其進行置換，均不會明顯影響多肽的功能。此外，使用丙氨基酸“A”替代S365-374第6位“S”絲氨酸

10、，也不會影響多肽的功能。而其他突變多肽片段誘導IFN-γ產(chǎn)生的能力均下降。因此，推斷S366-374(CYGVSATKL)是SARS-CoV S蛋白的一個CTL表位，其中第2，9位的“Y，L”為可能為其主要的錨著殘基。綜上所述，本研究從不同角度出發(fā)著重研究了SARS．CoV S DNA疫苗免疫機體誘導的抗原特異性細胞免疫的特征，特別是研究了其誘導的記憶性T細胞的特征。同時，本研究不但鑒定了四條SARS S抗原的H-2<'d>限制性表位肽