SARS冠狀病毒N蛋白和E蛋白特異性細(xì)胞免疫記憶及T細(xì)胞表位的研究.pdf

1、嚴(yán)重急性呼吸綜合征(severeacuterespiratorysyndrome，SARS)是2002年底最先出現(xiàn)在我國(guó)廣東省的一種新的傳染性疾病。該病起病急，傳染性強(qiáng)，短短數(shù)月時(shí)間內(nèi)全球SARS感染患者確診病例已超過(guò)8000例，死亡病例達(dá)774例，是一種嚴(yán)重危害人民生命健康的嚴(yán)重傳染病?，F(xiàn)已明確一種新的冠狀病毒為導(dǎo)致SARS的病原體，并命名為SARS冠狀病毒(severeacuterespiratorysyndromecoronavi

2、rus，SARSCoV)。盡管SARS第一次全球爆發(fā)已被控制，但對(duì)于SARS的認(rèn)識(shí)不深，目前既無(wú)特效的藥物用于治療，又未研制出有效的疫苗用于預(yù)防，因此很有必要繼續(xù)深入研究以探索新的防治SARS的方法。 SARS-CoV基因組為單股正鏈RNA，全長(zhǎng)約30kb，至少編碼4種主要的結(jié)構(gòu)蛋白：刺突蛋白(Spikeprotein，S)、膜蛋白(Membraneprotein，M)，包膜蛋白(Envelopeprotein，E)和核衣殼蛋白

3、(Nucleocapsidprotein，N)。SARS冠狀病毒的結(jié)構(gòu)蛋白誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答具有保護(hù)性作用，但有些蛋白可能會(huì)誘導(dǎo)有害的免疫反應(yīng)和/或炎癥性的反應(yīng)，導(dǎo)致病理?yè)p傷。成功開(kāi)發(fā)針對(duì)SARS的保護(hù)性疫苗需要了解不同的免疫系統(tǒng)成分在保護(hù)性免疫應(yīng)答中的作用及鑒定保護(hù)性的抗原。表位是與TCR/BCR特異性結(jié)合的基本結(jié)構(gòu)單位。大分子抗原一般由多個(gè)抗原表位組成，不同的表位誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答不同。因此，鑒定SARS冠狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白的表位，有助于開(kāi)發(fā)針

4、對(duì)SARS的免疫防治措施。 疫苗是遏制傳染病的最強(qiáng)有力的手段，而免疫記憶反應(yīng)的誘導(dǎo)是疫苗成功的基礎(chǔ)。目前對(duì)SARS-CoV的免疫記憶的研究主要集中在B細(xì)胞免疫記憶上，在所有SARS病人體內(nèi)均可檢測(cè)到特異性抗體，其特異性IgG可在體內(nèi)維持至少2年。然而，對(duì)人感染SARS-CoV后T細(xì)胞的免疫記憶反應(yīng)知之甚少。病毒感染后免疫保護(hù)作用主要由細(xì)胞免疫介導(dǎo)，因而探討SARS-CoV感染后T細(xì)胞的免疫記憶反應(yīng)的產(chǎn)生和維持對(duì)于設(shè)計(jì)有效的疫苗極

5、為重要。 N蛋白為病毒體的內(nèi)部蛋白，在SARS病毒的四個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白中最保守，并且在感染過(guò)程中的表達(dá)也是最豐富的。對(duì)其他冠狀病毒的研究表明N蛋白可誘導(dǎo)產(chǎn)生具有保護(hù)作用的細(xì)胞免疫應(yīng)答。因此N蛋白可能是SARS-CoV疫苗研究中最理想的候選抗原。E蛋白是最小的結(jié)構(gòu)蛋白，只有76個(gè)氨基酸，主要散布在病毒上，協(xié)同M蛋白參與包膜的形成。由于其在病毒的含量少，一直沒(méi)有得到深入的研究。但是近來(lái)的研究表明E蛋白作為冠狀病毒的一種膜蛋白具有重要的生物

6、學(xué)功能，E蛋白的免疫學(xué)研究也不能被忽視。因此，在本論文研究中，我們選擇N和E蛋白作為研究對(duì)象，探討其誘導(dǎo)的免疫記憶反應(yīng)并鑒定了其T細(xì)胞表位。 在本論文的第一部分，我們用ELISA和ELIspot方法證明N抗原特異性T細(xì)胞免疫記憶反應(yīng)存在于所有的SARS恢復(fù)期病人體內(nèi)，并可維持至少2年。用流式細(xì)胞術(shù)在SARS病人體內(nèi)證明CD4+和CD8+T細(xì)胞均參與SARS-CoVN蛋白特異性免疫記憶反應(yīng)，但以CD8+T細(xì)胞反應(yīng)為主。CD4+和C

7、D8+記憶T細(xì)胞在N抗原的刺激下可迅速產(chǎn)生IFN-γ和IL-2。表型分析表明抗原特異性IFN-γ+CD8+T細(xì)胞大部分為T(mén)EM表達(dá)CD45RA+CCR7-CD62L-，而大部分的IFN-γ+CD4+T細(xì)胞為T(mén)CM表達(dá)CD45RA-CCR7+CD62L-。我們用SARS病人的PBMC對(duì)跨越N蛋白全長(zhǎng)的57種合成肽進(jìn)行T細(xì)胞表位篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中N46(aa331～347)、N47(aa339～354)和N48(aa346～362)能被大多

8、數(shù)SARS病人的T細(xì)胞所識(shí)別。因此認(rèn)為N蛋白的第331～362氨基酸區(qū)域是被T細(xì)胞識(shí)別的優(yōu)勢(shì)表位區(qū)，至少含有兩個(gè)T細(xì)胞表位(N46和N48)。與以前的文獻(xiàn)報(bào)道相比較，我們的研究表明SARS-CoV表位特異性的T細(xì)胞的頻數(shù)與其他急性病毒感染后的記憶細(xì)胞頻數(shù)相當(dāng)。由于SARS-CoV不存在持續(xù)感染，并且臨床上也從未發(fā)現(xiàn)重復(fù)感染，因此可以說(shuō)SARS病人體內(nèi)N蛋白特異性T細(xì)胞免疫記憶的維持是抗原非依賴(lài)性的。 在本論文的第二部分，我們用E

9、LISA和ELIspot方法證明E抗原特異性T細(xì)胞反應(yīng)存在于SARS恢復(fù)期病人中，并可維持至少2年。用流式細(xì)胞術(shù)在SARS病人體內(nèi)證明CD4+和CD8+T均參與SARS-CoV的E蛋白特異性免疫記憶反應(yīng)，并且在E抗原的刺激下可迅速產(chǎn)生IFN-γ和IL-2。表型分析表明E蛋白特異性IFN-γ+CD8+T細(xì)胞大部分為T(mén)EM表達(dá)CD45RO-CCR7-CD62L-，而更多的特異性IFN-γ+CD4+T細(xì)胞為T(mén)CM表達(dá)CD45RO+CCR7+C

10、D62L-。我們用SARS病人的PBMC對(duì)跨越E蛋白全長(zhǎng)的9種合成肽進(jìn)行T細(xì)胞表位篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中E2(aa9～26)、E5(aa33～49)和E6(aa40～57)能被大多數(shù)SARS病人的T細(xì)胞所識(shí)別。因此認(rèn)為E2(aa9～26)、E5和E6(aa33～57)是E蛋白中被T細(xì)胞優(yōu)先識(shí)別的區(qū)域，至少含有兩個(gè)T細(xì)胞表位。SARS-CoVE蛋白特異性的記憶T細(xì)胞的頻數(shù)低于N蛋白表位特異性的記憶細(xì)胞頻數(shù)，表明E蛋白的抗原性較弱。 本